[发明专利]一种用于塞内卡病毒抗体检测的固相竞争ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于塞内卡病毒(Seneca Valleyvirus,SVV)抗体检测的固相竞争ELISA试剂盒，其特征在于包括塞内卡病毒灭活抗原包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标板按照以下方法制备得到：

(1)SVV灭活抗原的包被

将10^8.50TCID50/ml的SVV灭活抗原用pH7.2的碳酸盐缓冲液进行1:20的稀释，之后在ELISA板的每孔加50μl抗原稀释液，4℃静置8～12小时；

(2)酶标反应板稳定剂的配制

将5g BSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用；

(3)酶标反应板的封闭方法

弃去酶标板孔内的抗原稀释液，加入洗涤液，室温下振荡洗涤2分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，甩干酶标板；之后按150μl/孔的量加入步骤(2)制备得到的酶标反应板稳定剂，4℃过夜，弃去稳定剂，拍干并置通风厨中吹干酶标板，用铝箔袋加入干燥剂真空包装，4℃保存备用。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG按照以下方法制备得到：

(1)获得SVV高免兔血清；

(2)离心去除SVV高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml 1mol/L CaCl₂溶液和0.4ml 5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；

(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；

(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na₃PO₃缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na₃PO₃缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV兔抗IgG；

(5)HRP标记SVV兔抗IgG的制备

将纯化之后的5mg/mL的SVV兔抗IgG 0.3mL与0.1mL过氧化物酶加入1.5mL的EP管中，轻轻吹打混匀，4℃过夜；向混合物中加入40μL的三乙醇胺，混匀，加入50μL的硼氢化钠，混匀，4℃放置30min。再次加入10μL甘氨酸溶液，混匀，之后将混合液置于透析袋中透析，所用的透析液为pH 7.2的PBS缓冲液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括洗涤液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液以及终止液。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液是含有5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4，使用时稀释10倍使用；所述的样品稀释液是含有5w/w％牛血清白蛋白、5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4，使用时稀释10倍使用；所述的酶标抗体稀释液是含有1v/v％甘油、0.5w/v％牛血清白蛋白、1w/v％酪蛋白以及0.05w/v％Procline300的0.01mol/L PBS缓冲液，pH7.4；所述的显色液为ABTS或TMB显色液；所述的终止液为2mol/L的H₂SO₄溶液；所述的阳性对照为塞内卡病毒阳性血清，所述的阴性对照为塞内卡病毒阴性血清。