[发明专利]一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒检测试剂盒及其应用，特别涉及基于塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)特异性酶标抗体技术建立的用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。本发明属于生物检测技术领域。

背景技术

SVV也被称为塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)，其对美国猪群来说并不陌生。在过去30年中，共有近20例SVV感染被确认。在美国，SVV通常与特发性猪水疱病有关。在全球范围内都有SVA的报道，包括加拿大、澳大利亚、意大利、新西兰和巴西。SVV是一种无囊膜、单链RNA病毒，与猪口蹄疫(FMD)和猪水疱病毒一样，属小RNA病毒科。它可能是猪特发性水疱病的病原体，但是这种观点尚未得到证实。

2015年9月，美国某种猪场猪群出现跛足、水泡且伴随初生仔猪死亡，PCR检测排除FMDV、PDCoV、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、A/B/C型猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪呼吸与繁殖综合症病毒(PRRSV)的感染，发病猪的血清、皮肤、粪便、蹄部冠状带的PCR检测结果显示为SVV阳性，并通过猪睾丸细胞(ST细胞)分离得到SVV。

2015年3月，我国广东某猪场超期断奶猪被发现跛行，将发情母猪赶去配种舍定位栏冲洗干净后，发现一头猪出现鼻镜水泡，送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示口蹄疫、猪水疱病病原检测均阴性而猪场的发病仍在扩大，最终通过对病料进行多种病原的检测送测序后获得一段序列，经与基因数据库比对，发现与SVV序列的相似性最高，继而查找资料，确定发病猪群感染SVV，并分离到SVV细胞株。随后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陆续在其他猪场发现猪群感染SVV病例，而且一直呈现上升趋势。

由于SVV感染动物所引起的症状与其他病毒性疾病如口蹄疫、水泡性口炎病、猪水疱病临床表现十分相似，给临床确诊带来了难度。因此，需要实验室技术加以确定。目前主要包括病毒分离、抗体检测和抗原检测等。抗体检测方法主要包括血清中和试验(特异性高，广泛应用于血清学调查)和ELISA法(适用于猪血清大规模普查)。病原学检测方法主要是免疫组化试验，该方法是抗原检测敏感且特异的方法，主要体现在能定位病原在组织细胞中的分布。RT-PCR技术通常具有特异性高、可靠、快速，广泛应用于分子生物学检测。目前应用于SVV诊断的检测方法程序繁多、操作步骤复杂，检测至少需要一天的时间才能获得结果，因此在疫情突发时无法实现大量的样品的即时检测。要克服现状就必须研制新型ELISA诊断技术，本发明所涉及的检测方法是以轻简化或精准为目标的新型定性定量技术。

另外，鉴于目前国内外尚未有血清学诊断方法的报道，唯一能检测抗原的方法为病毒分离，本方法属于首创SVV抗原检测的ELISA试剂盒，相对于病毒分离而言，本发明具有简便、敏感、稳定及省时等特点，为SVV抗原检测提供了一种有效的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒，其中包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述的酶标板按照以下方法制备得到：

(1)获得SVV豚鼠高免血清；

(2)离心去除SVV豚鼠高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml 1mol/L CaCl₂溶液和0.4ml 5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；

(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；

(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na₃PO₃缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na₃PO₃缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV豚鼠抗IgG；