[发明专利]一种Mdr1a/1b双基因敲除的方法及应用

权利要求书

1.一种Mdr1a/1b双基因敲除的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)Mdr1a与Mdr1b靶点的选择；

利用在线靶点预测网站选择Mdr1a与Mdr1b敲除靶点；

(2)sgRNA的合成与提取；

首先合成一段长度为60bp的Oligo片段，其中包括敲除靶点和T7启动子的序列；然后，以Oligo片段为模板，通过重叠PCR反应合成完整的sgRNA双链模板，长度为130bp，并经酚氯仿提取的方法将sgRNA双链模板提取分离；最后，用T7体外转录试剂盒将sgRNA双链模板进行体外转录，将转录产物提取分离，得到Mdr1a和Mdr1b基因的sgRNA；

(3)sgRNA和Cas9 mRNA共注射与胚胎移植；

将两种sgRNA与Cas9 mRNA显微共注射入大鼠受精卵胞浆中；其中，所述sgRNA为Mdr1a和Mdr1b基因的sgRNA；

(4)F0代基因型鉴定；

提取F0代大鼠基因组DNA，并设计引物分别扩增Mdr1a和Mdr1b基因靶点附近序列，连接载体进行测序，鉴定基因突变情况；

(5)F0代繁育与F1代基因型鉴定；

将同时携带Mdr1a/1b可用突变的F0代与野生型合笼，将F1代基因组提取后PCR扩增Mdr1a和Mdr1b基因靶点附近序列，进行测序；

(6)F1代繁育与F2代基因型鉴定；

将携带Mdr1a/1b可用突变的F1代雌雄个体进行交配，得到F2代，将F2代基因组提取后PCR扩增Mdr1a和Mdr1b基因靶点附近序列，得到Mdr1a/1b基因敲除的个体；

(7)脱靶效应检测；

根据脱靶效应预测网站，找到针对Mdr1a或Mdr1b的sgRNA所引起脱靶可能性较大的位点，设计引物验证这些位点是否发生突变。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，其中，Mdr1a基因敲除靶点序列为如SEQ ID NO.1所示的5’-AGATAGCTTTGCAAATGT-3’；Mdr1b基因敲除靶点序列为如SEQ IDNO.2所示的5’-CCTCCTGATGCTGGTGTT-3’。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，其中，包含Mdr1a基因敲除靶点的Oligo片段序列为如SEQ ID NO.3所示的5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGAGATAGCTTTGCAAATGTGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’；包含Mdr1b基因敲除靶点的Oligo片段序列为如SEQ ID NO.4所示的5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGCCTCCTGATGCTGGTGTTGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述Mdr1a基因的sgRNA、Mdr1b基因的sgRNA、Cas9 mRNA的浓度比为1-2∶1-2∶1-2；两种sgRNA与Cas9 mRNA三者混合后每个受精卵注射0.1μL-0.2μL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中，检测由针对Mdr1a的sgRNA所引起脱靶现象时，所选潜在脱靶位点及所用引物具体信息为：Mdr1a_off_1：上游引物GGTCAAGGCTTTACTCATAT，下游引物TGTAGGACTATAAGTGGTGC，产物长度＝519bp，最佳退火温度＝56℃；Mdr1a_off_2：上游引物AAACAAGAACTTAGCCACAG，下游引物GTATCCCTTACAAAGCAACA，产物长度＝472bp，最佳退火温度＝56℃；Mdr1a_off_3：上游引物CTTGGGAAGCATAGCAGACA，下游引物CCATATTCTAAGGCCCATCT，产物长度＝501bp，最佳退火温度＝56℃；Mdr1a_off_4：上游引物GGCGTACAAAGTGACAAGAT，下游引物TCAAAGGAATGAAGACTGAAAT，产物长度＝503bp，最佳退火温度＝53℃。