[发明专利]一种猪圆环病毒分离方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒分离方法，其特征在于由以下步骤组成：

1）无菌采取具有PMWS症状和剖检病变的自然病例的淋巴结、肺脏、脾脏和扁桃体等组织，放置于绞肉机中绞碎，向肉糜中加入肉糜总质量1-5倍的病毒处理液，经胶体磨充分研磨，混合均匀；将得到的混合液置于高压匀质机内，在匀质处理过程中温度控制在27℃以下，即得到匀浆处理液；在匀浆处理液中按1:1-1:2加入病毒处理液，混合均匀，静置10-15min后，进行分装离心，3000-5000r/min，离心5-10min，取上清待用；取上清液首先通过0.65-0.1um孔径进行微滤处理，收集微滤液，按1:1-1:5加病毒处理液，将稀释好的微滤液通过孔径300KD-800KD的中空纤维膜微滤系统进行处理，收集滤液，即PCV2原液；

所述的病毒处理液通过以下步骤制得：

取蔗糖1-8 g、氯化钾0.5-2 g、氯化钠1-5 g、芍药苷20-40 mg、L-谷氨酸钠0.5-1 g、青霉素60-100 mg和链霉素60-100 mg；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，并且用0.1M的NaHCO₃调PH至8.0-10.0，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用

2）取小鼠淋巴细胞进行贴壁培养；

3）取已培养24h贴壁生长良好的小鼠淋巴细胞，弃去细胞培养液，将PCV2原液与维持液按体积比1:10-1:20比例接种至细胞瓶内，同时设PCV2的阳性对照和空白对照组，将细胞瓶置于37℃、 5%CO₂培养箱中培养96-120h，收集病变明显的细胞液，置于-20℃保存；

所述维持液通过以下步骤制得：

取D-氨基葡萄糖0.5-10 g、三七皂苷1-10 g和海藻多糖0.5-5 g；

将以上各成分混合后，溶于1000 ml DMEM，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

2.如权利要求1所述的一种猪圆环病毒分离方法，其特征在于所述的步骤2）中小鼠淋巴细胞进行贴壁培养具体为：将BALB/c小鼠断髓处死，无菌分离小鼠双侧领下、腋窝、浅腹股沟及肠系膜淋巴结，200目筛网研磨过滤，收集细胞，用PH7.0-7.4的冷PBS洗涤细胞2次后，用RPMI-1640完全细胞培养基重悬，进行计数并调整细胞浓度为1×10⁵-1×10⁶个/ml，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中分别培养0.5、1、2、6、24 h后，更换新培养液，最后剩余细胞均为贴壁细胞。

3.如权利要求1所述的一种猪圆环病毒分离方法，其特征在于所述的步骤3）中将PCV2原液与维持液按体积比1:12-1:18比例接种至细胞瓶内。