[发明专利]猪脂肪沉积相关PNPLA2mRNA m6A甲基化位点的鉴定方法和功能应用

说明书

猪脂肪沉积相关PNPLA2 mRNA m6A甲基化单位点的鉴定方法，根据m⁶A‑seq测序得到的是100nt左右的片段中存在m⁶A甲基化位点，其特征在于：根据甲基化高度保守的RRACH(R＝G,A；H＝A,C,T)序列进行PNPLA2基因的m6A单位点位置的确认。本发明通过生物信息学分析，根据m6A的保守序列，鉴定了m6A的具体位点；本发明提供了在猪中鉴定PNPLA2 mRNA m6A甲基化水平的引物序列和具体方法；本发明通过基因单位点突变改变PNPLA2 m6A水平证明了PNPLA2 m6A位点对脂肪沉积的影响的功能。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种单个基因mRNA m⁶A甲基化位点鉴定、功能及应用，具体涉及PNPLA2 mRNA m6A甲基化位点鉴定、功能及应用。

背景技术

猪脂肪合理沉积及调控一直是畜牧业关注的焦点问题。猪脂肪过度沉积不仅降低养分利用效率，而且过高的体脂沉积会直接影响消费者的健康，包括易引发肥胖带来的糖尿病和心血管等代谢疾病；而猪体脂过少沉积则带来猪肉品质较差、免疫力低下、易感染疾病和繁殖性能下降等一系列问题。中国地方猪种多为高脂肪，称为脂肪型猪；引入猪种的瘦肉率高，称为瘦肉型猪。猪种胴体脂肪组成的遗传差异涉及基因繁多，基因调控复杂，一直是遗传育种领域研究的难题之一。

近年来，mRNA差异显示法、基因芯片技术、转录组高通量测序、DNA甲基化高通量测序等已广泛应用于相关功能基因的筛选领域(Bulow et al.,2008；Weber et al.,2008；Mingzhou Li,et al.,2012)。与其他基因筛选方法相比，m6A-seq技术从mRNA转录后修饰水平进行差异基因筛选，与生物功能执行大分子—蛋白更近一步，更能精准定位差异基因。RNA甲基化修饰发现于1974年，是一种最常见的转录后水平修饰，大约占全部RNA修饰的三分之二。在真核生物中，最常见的mRNA转录后修饰是发生在碱基A第6位N原子上的甲基化修饰，m6A大约占细胞mRNA全部腺苷含量的0.1％-0.4％，即哺乳动物中平均每一条 mRNA含有3-5个6-甲基修饰的腺苷。m6A甲基化位点主要发生在高度保守的RRACH(R＝G,A； H＝A,C,T)序列中，在表观遗传中可能发挥重要的作用。

脂肪甘油三酯脂酶PNPLA2对脂肪沉积具有重要的调控作用，同时根据前期测序发现 PNPLA2 mRNA的m6A甲基化水平在脂肪型和瘦肉型猪中存在较大的差异，因此有必要对PNPLA2的mRNA的m6A甲基化位点、功能进行鉴定，为猪脂肪沉积遗传性状的改良提供一种新的分子标记。

发明内容

本发明目的是提供一种与猪脂肪沉积相关PNPLA2 mRNA m⁶A甲基化位点鉴定方法、一种检测PNPLA2 mRNA m⁶A甲基化水平相对差异的方法、一种在基因水平改变PNPLA2mRNA m⁶A甲基化水平的方法、PNPLA2 mRNA m⁶A甲基化位点对脂肪沉积功能鉴定方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

猪脂肪沉积相关PNPLA2 mRNA m6A甲基化单位点的鉴定方法，根据m⁶A-seq测序得到的是100nt左右的片段中存在m⁶A甲基化位点，其特征在于：根据甲基化高度保守的RRACH(R＝G,A； H＝A,C,T)序列进行PNPLA2基因的m6A单位点位置的确认。