[发明专利]抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位及其筛选方法和应用

权利要求书

1.抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体抗原表位的筛选方法，包括以下步骤：

1)将野生型H7N9亚型禽流感病毒液与具有中和特性的单克隆抗体腹水等体积混合，20～28℃孵育1h，得到病毒抗体混合液，所述单克隆抗体由灭活野生型病毒株免疫动物通过杂交瘤技术得到；

2)将所述步骤1)得到的病毒抗体混合液接种至SPF鸡胚，将接种后的SPF鸡胚在35℃条件下培养72h，得到尿囊液；

3)测定所述步骤2)得到尿囊液的血凝效价；

4)将所述步骤3)中测定结果为阳性的尿囊液进行梯度稀释，将稀释后的尿囊液分别与0.5ml单克隆抗体腹水等体积混合，20～28℃孵育1h，孵育后的梯度稀释病毒抗体混合液分别接种至SPF鸡胚；

5)测定所述步骤4)中接种72h得到尿囊液的血凝效价，选择最大稀释度病毒抗体混合液接种鸡胚所获得的阳性尿囊液为抗原，测定单克隆抗体的血凝抑制效价，当所述尿囊液测定的血凝抑制效价比野生型病毒测定的血凝抑制效价低8log2时，判定阳性尿囊液为单克隆抗体的逃逸株；

6)将所述步骤5)得到的单克隆抗体的逃逸株接种至SPF鸡胚培养，获得鸡胚尿囊液；

7)以所述步骤6)得到的尿囊液为样品，利用RT-PCR法扩增HA基因，对得到的PCR产物进行测序，将所述测序得到的HA基因序列翻译成氨基酸序列与野生型H7N9亚型禽流感病毒的HA基因氨基酸序列进行比对，氨基酸差异位点即为单克隆抗体所针对的抗原表位，鉴定出抗H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体的特定抗原表位；

扩增HA基因用引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中Seq IDNo.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中Seq ID No.2所示的核苷酸序列；

所述步骤2)、步骤4)或步骤6)中接种的接种量为每个SPF鸡胚接种0.1ml；

所述步骤1)中H7N9亚型禽流感病毒液的病毒浓度为10⁶EID₅₀/0.5ml；

所述步骤4)中梯度稀释包含四个梯度，分别为稀释后的浓度为10^-5、10^-6、10^-7和10^-8。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述RT-PCR法的反应程序为预变性95℃3min；变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃1min40s，共35个循环；延伸72℃5min。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)H7N9亚型禽流感病毒液与单克隆抗体腹水混合前预先稀释；所述稀释用溶液为PBS溶液；

所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L；

所述PBS溶液的pH值为7.4。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)、步骤4)和步骤6)中SPF鸡胚为10日龄鸡胚。

5.权利要求1～4任意一项所述方法筛选得到的H7N9亚型禽流感病毒的特定抗原表位，所述抗原表位由HA基因编码的蛋白质第136位氨基酸突变为G和第227位氨基酸突变为E组成；

所述HA基因是以H7N9亚型禽流感病毒A/CHICKEN/JIANGSU/W1-8/2015为基本病毒株，用正向引物和反向引物扩增得到；所述正向引物具有如序列表中Seq ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中Seq ID No.2所示的核苷酸序列。

6.针对权利要求1～4任意一项所述方法筛选得到的抗原表位的或者权利要求5所述抗原表位的单克隆抗体在免疫检测试剂中的应用。