[发明专利]人源化基因改造动物模型的制备方法及应用

说明书

本发明涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化OX‑40基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术领域

本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化OX40基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。

背景技术

通常，在人疾病的研究中期望使用人的细胞进行实验。特别是，在确认物种特异性的多个药物代谢酶、宿主局限的免疫反应等所参与的疾病的研究中，需要使用人源基因表达的模型。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠，豚鼠，地鼠(仓鼠)，兔，犬，猴，猪，鱼等。然而，人类和动物的基因和蛋白质序列还是存在不少差异，许多人类蛋白质不能与动物的同源蛋白质结合而产生生物活性，导致许多临床试验的结果也与动物实验的结果不相符。大量的临床研究急需更好的动物模型。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanized animal model)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即，利用基因遗传操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同类基因，可在动物体内建立更接近人类的正常或突变基因体系的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化还可改进和提升细胞人源化小鼠模型，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达含有人类功能的蛋白质，从而大大减少人和动物的临床实验差异，为在动物水平进行药物筛选提供了可能。

癌症是目前导致人类死亡率最高的疾病之一。据世界卫生组织统计，2012年全球恶性肿瘤发病和死亡病例数达到1400万和820万，中国新诊断癌症病例为307万，死亡人数220万。近年，针对免疫检查点的抗体药物研发被认为是有望攻克各类癌症的潜在靶点。传统的药物研发中，都是采用体外药效筛选的方式，该筛选方法不能模拟体内环境，例如肿瘤微环境、基质细胞、胞外基质成分以及免疫细胞互动等，造成研发失败率较高。另外，鉴于人和动物的差异，使用常规实验动物进行体内药理药效检测结果，并不能反映真实的疾病状态和靶位点的识别互动，导致许多临床试验的结果与动物实验的结果相去甚远。因此，开发适合人源抗体筛选和评价的人源化动物模型，将可显著提高新药开发效率，并降低研发成本。

T细胞的活化过程除需要TCR识别MHC-肽复合物作为第一信号外，还必需协同刺激信号对其进行进一步充分活化。OX40是一类T细胞的共刺激因子，它属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一员，为I型跨膜蛋白。在特定的条件下，OX40能够激活细胞内PI3K-AKT信号以及NFAT信号。这些信号对于T细胞的增殖以及存活具有积极的意义。另一方面，OX40也能够调控T细胞的功能与分化方向。

OX40是迄今为止发现的唯一能建立外周耐受的共刺激分子，可以打破肿瘤的免疫耐受，恢复免疫监视。将OX40作为肿瘤免疫治疗的新靶点已经显示出积极作用，但由于激活性抗体因需结合的表位和状态刚好和相应配体一致，犹如钥匙开锁般匹配，才能激活下游信号通路，所以此类抗体的研发难度很高。目前大多数研究尚处于起步阶段，药物研发也都尚处于临床I期或II期。所以目前急需更深入的研究OX40协同刺激分子，为协同刺激分子在肿瘤免疫及其他免疫性疾病方面提供更有价值的线索。

WO2007/062245A公开了特异性结合OX40胞外域特定氨基酸序列中特定表位的分离或纯化的抗体。抗体包括结合哺乳动物OX40特定序列的人、人源化和嵌合抗体。抗体还包括具有OX40拮抗活性的那些抗体。抗体进一步包括具有OX40激动活性的那些抗体。

WO2013/038191A公开了特异性结合人CD134(OX40)的抗体。特异性结合人CD134的胞外结构域，包括人CD134上的非OX40配体(OX40L)结合结构域。抗人CD134抗体可用于癌症治疗。