[发明专利]一种多环芳烃污染土壤中外源降解菌的施加方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多环芳烃污染土壤中外源降解菌的施加方法，特别涉及一种针对多环芳烃污染土壤及环境中外源降解菌定量、特异检测及施加的方法，属于土壤微生物检测技术领域。

背景技术

有机污染土壤的生物修复法因具有成本低、无二次污染、可大面积应用等优点受到广泛关注。生物强化法是生物修复的重要手段之一，其主体是人为投加有高效降解能力的降解菌或菌群。外源降解菌进入污染环境后，会受污染物胁迫，并与土著菌竞争，其存活和增殖情况在整个修复期内呈现动态变化。通过对降解菌进行实时定量的追踪，可准确了解其进入环境后的存活和增殖情况，从而改进修复时菌剂的投加量和投加方式，提高修复效果。因此有必要开发出针对特定外源降解菌在环境中的数量检测方法。

传统的微生物数量检测方法有稀释平板法、血球计数板法等，但这些方法只能对样品中的全部微生物进行无差别的计数，无法对样品中的微生物进行准确的种属区分，因此无法排除环境样品中土著微生物的干扰对特定菌株进行数量检测。

实时荧光定量PCR技术具有灵敏性高、精确性好、特异性强和安全快速等优点，已被应用于检测环境样品中的目标微生物。但目前基于实时荧光定量PCR技术对有机污染土壤及其他环境样品中微生物的定量方法多以16S/18S rDNA或功能基因为目的基因，研究多集中于某类或某几类土著降解菌，缺少对某种特定外源降解菌进入环境后的数量分布情况的关注。其主要技术难点在于针对能够高效处理有机污染物的外源微生物菌株，需要找到该微生物菌株与土著降解菌及土著同种属菌具有差异的特异性基因序列及特异性引物。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种多环芳烃污染土壤中外源降解菌的施加方法。

本发明的技术方案如下：

一种多环芳烃污染土壤中外源降解菌的施加方法，步骤如下：

(1)采集土壤样品，测定含水率，-20℃以下保存；

(2)提取样品中的基因组DNA，制得DNA模板；

(3)对步骤(2)制得的DNA模板进行实时荧光定量PCR扩增，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后根据标准曲线，计算目标菌数量；所述标准曲线如下：

Y＝-3.365X+37.624；

其中：R²＝0.9999，Y为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X为菌的标准质粒拷贝数对数值；

(4)调整土壤含水率至20-50％，疏松土壤，根据土壤多环芳烃污染物含量及土壤营养元素含量，添加氮磷肥料，调节污染土壤的碳、氮、磷的摩尔比为(100～120)：(5～10)：1，投加外源假单胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1的数量至10⁹CFU/g土，隔周翻搅一次，维持土壤含水率20～50％，每周检测外源降解菌的数量及多环芳烃残留量，当外源降解菌数量低于10⁷CFU/g土时，补加外源假单胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1的数量至10⁹CFU/g土，直至多环芳烃残留量达到处理要求。

所述外源假单胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1分离自多环芳烃污染土壤，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC No.12596。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，荧光定量PCR扩增的反应体系如下，总体系20μl：

2×SybrGreenqPCR Master Mix10μl；浓度10μM的上游引物0.4μl；浓度10μM的下游引物0.4μl；ddH₂0 7.2μl；DNA模板2μl；

所述荧光定量PCR扩增的反应条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，45个循环。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，多环芳烃为菲。

有益效果

本发明首次通过利用实时荧光定量PCR的方法特异性监测土壤中外源多环芳烃降解菌假单胞菌(Psedomonas sp.)PPZ-1，并通过控制土壤中的外源多环芳烃降解菌的菌量实现快速降解土壤中多环芳烃的目的。

附图说明

图1、琼脂糖凝胶电泳图；

图中：1、2、3、4分别对应实施例1中引物组1、引物组2、引物组3和引物组4，土1为济南土，土2为浙江土；

图2、实时荧光定量PCR扩增曲线图；

图3、实时荧光定量PCR熔解曲线图；