[发明专利]一种高产cAMP的酵母菌株及其应用

说明书

本发明提供一种能过量合成胞外cAMP的酵母菌株及其构建方法、发酵工艺与在医药、畜牧业、食品、保健品或化工领域中的应用。所述酵母菌株包括第一种和第二种基因修饰，其中，所述第一种基因是蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)催化亚基编码基因TPK1，TPK2和TPK3，通过修饰第一种基因使PKA活性或表达被完全抑制，从而消除对环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的反馈抑制，但同时使得酵母的生长被抑制，第二种基因修饰消除了第一种基因修饰导致的生长抑制，从而使得酵母能够正常生长，所述酵母的cAMP产量上升。所述酵母菌株还包括第三种、第四种基因修饰和/或第五种基因修饰。本发明的重组酵母菌株能稳定、持续、高效生产胞外cAMP。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种能过量合成胞外cAMP的酵母菌株及其构建方法、发酵工艺与在医药、畜牧业、食品、保健品或化工领域中的应用。

背景技术

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)是人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，其作为细胞内的第二信使，对糖代谢、脂肪代谢、核酸合成、蛋白质合成等起着重要的调节作用。目前cAMP在医药方面用途广泛：临床上cAMP用于治疗心绞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克等；对改善风湿性心脏病的心悸、气急、胸闷等症状有一定的作用；可提高急性白血病结合化疗的疗效，亦可用于急性白血病的诱导缓解；此外，对老年慢性支气管炎、各种肝炎和银屑病也有一定疗效。cAMP也可作为药物中间体制备二丁酰环磷腺苷和环磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的生理及药理作用。cAMP还可用作畜禽食品添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。

cAMP的生产方法有化学合成法、酶促转化法和发酵法三种。目前国内外产业化生产全部采用以腺苷一磷酸(Adenosine-5’-monophosphate,简称AMP)为原料的化学合成法，其采用高效分离柱进行中间体分离，操作复杂，且所涉及的试剂昂贵，采用大量的吡啶作为溶剂也造成严重的环境污染。酶促转化法即以腺苷酸环化酶(E.C.4.6.1.1，Cyr1p)为酶源催化ATP原料一步生产cAMP，但此法存在底物昂贵、腺苷酸环化酶含量低、纯化困难、稳定性差等限制，故目前还局限于实验室阶段，离产业化还有相当的距离。相比之下，微生物发酵法生产cAMP具有如下的一些优点：条件温和、工艺简单、能利用廉价的碳源，副产物少、环境污染小，可实现持续生产等等，是有潜力的、值得大力开发的工艺。

目前利用液化短杆菌、微杆菌、棒状杆菌、节杆菌、大肠杆菌等细菌发酵法生产cAMP已有一定的研究，但面临重复性差、产量不稳定、成本高、难以工业化等问题。而酵母尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为最重要的工业微生物之一，不仅具有工业化应用技术成熟、抗逆性强、为食品安全性GRAS微生物的优点，同时作为最早实现全基因组测序的微生物菌种，又是分子生物学和遗传学研究的最重要模式生物之一，cAMP信号通路及其调控相关的基础研究深入，遗传操作技术手段完善。遗憾的是目前国内外的研究都集中于胞内cAMP的信号调控功能，还没有将其作为一个产品从而关注胞外生产情况的专门研究。若研究酵母胞外cAMP产生规律，并通过基因工程手段改造实现以过量生产胞外cAMP酵母为菌种的发酵法生产，将极大地降低成本、简化工艺，从而为微生物发酵生产cAMP开辟新的途径，推动高值医药和生化产品的绿色清洁生产，具有重要的经济价值和社会意义。

而cAMP在畜牧业领域的应用，到目前为止因cAMP只能被注射使用而停留在研究阶段。如能解决使用方法问题，必将有利于充分发挥其广泛的营养代谢调节作用，而实际成为非激素类安全无残留无污染因而有良好应用前景的动物促生长剂，可供直接用作饲料添加剂，或制备成饲料添加剂。

发明内容

发明概述