[发明专利]一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其方法

说明书

本发明公开的一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒，包括杂交用试剂、PCR扩增试剂及富集度检测试剂；其中所述杂交用试剂包括如下SEQ NO.1‑SEQ NO.396探针混合物，且每条探针之间的摩尔数比均为1：1,检测时，浓度为10nM each的上述探针混合物用量为1μl。本发明的试剂盒是基于二代测序技术的基因检测，可一次性检测3种变异类型(突变、插入缺失、融合)，同时应用高测序深度覆盖微量基因变异，从而在样本有限的前提下精准检测患者的突变情况，可准确检测1％的突变频率。一方面，多基因高敏感性的平行检测提升了可用药基因变异的检出率，不错失用药的机会；另一方面，可在一次检测中同时检出热点、罕见甚至是未知的基因变异，在发现药物敏感性突变的同时检测相关的耐药突变(如KRAS和ALK点突变)，准确地反映患者用药后的敏感及耐药信息。

技术领域

本发明涉及基因突变检测领域，具体涉及为一种用于肿瘤个体化用药16个基因热点检测的杂交捕获试剂盒及其检测方法。

背景技术

随着肿瘤驱动基因的发现和相应靶向药物的研究和应用，肿瘤治疗已经走上了以基因为导向的个体化治疗之路。靶向治疗作用效率高，毒副作用低，可以更大程度提高肺癌患者的生存质量。然而，靶向治疗药物仅作用于带有特定基因突变的肿瘤细胞，对于不含特定基因突变的肿瘤细胞，靶向药物的疗效甚至不如化疗药物。因此，患者在接受靶向治疗前，必须进行相应的基因检测。

肿瘤组织来源的DNA携带有肿瘤细胞独有的基因特征，包括与肿瘤形成和发展有关的基因点突变、插入/缺失、基因融合、拷贝数变异和DNA甲基化异常等，以及肿瘤细胞用药相关的变异。本检测以新鲜血液或唾液等来源的正常细胞为参照样本，以肿瘤新鲜组织或石蜡包埋切片组织等为检测样本，利用靶向捕获技术通过高通量测序同步检测受检者肿瘤组织中16个基因的变异信息。根据检出的点突变、小片段插入/缺失和基因融合变异信息，结合国际相关用药指南分析受检者对相关靶向药物的用药敏感性、耐受性的个体化信息，供受检者参考。

本检测方法涉及16个肿瘤靶向药物用药相关的基因，包括ALK、APC、BRAF、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、RB1、RET、ROS1和TP53。检测该16个基因的点突变或单核苷酸多态性、小片段基因插入或缺失以及基因重排信息，详见下表：

本检测产品覆盖的靶向药物，详见下表：

人类基因组包含30亿碱基对，数据量庞大。即使是采用高通量测序技术，直接对全基因组进行测序也面临着成本高、数据分析复杂、周期长等问题。因此，综合考虑临床目的和经济效益，需要在测序之前先对感兴趣的基因序列进行富集。基因捕获技术作为检测环节中必备的关键技术，是精准医学的基础之一。基因捕获测序的主要优势在于可针对特定区域进行测序，有效降低了测序成本，提高了测序深度，更精确地发现特定区域遗传变异信息。目前常用的基因捕获方法包括杂交捕获和多重PCR扩增。其中，杂交捕获的特点是能够对外显子组甚至更大的目标区域进行捕获，覆盖度高，均一性高，测序深度高及灵敏度高，同时可匹配极短长度的模板片段或特殊结构的DNA，但操作流程相对多重PCR捕获技术较复杂，有时还需要依赖较多专门的仪器设备；多重PCR则操作简单灵活，模板要求量相对较低，对仪器要求最小化，能在数小时内完成目标序列富集和文库构建，一般仅适用于相对较小50Kb以下的目标序列进行捕获，且对于基因重排如基因融合或倒位、大片段缺失无法检测。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可用于高通量、高灵敏度、高稳定性、低成本，主要针对非小细胞肺癌的肿瘤个体化用药基因突变检测的试剂盒。本发明主要是利用液相探针杂交捕获技术对靶向用药基因、原癌基因、抑癌基因及细胞信号转导通路上的16个基因热点进行捕获富集，然后通过高通量测序技术对富集后的目标区域进行测序，最终通过生物信息学分析高通量测序数据，从而发现突变情况及其突变频率。