[发明专利]一种真菌表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种真菌表达载体，其特征在于，所述表达载体为由绿色荧光蛋白基因gfp、超表达真菌转录调控因子Som1基因和pBarEx质粒表达载体构成的组成性表达载体；所述超表达真菌转录调控因子Som1基因为绿僵菌MaSoml基因；

所述pBarEx的构建方法为：以构巢曲霉基因组DNA为模板进行扩增；并以pCAMBIA 3300质粒的DNA为模板扩增；以构巢曲霉基因组DNA的上游扩增引物为上游扩增引物、pCAMBIA3300扩增的下游扩增引物为下游扩增引物，采用融合PCR扩增得到Bar Cassette；将载体pAN52-1与除草剂抗性基因Bar基因的表达元件Bar Cassette分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建得到所述pBarEx；

所述构巢曲霉基因组DNA的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述构巢曲霉基因组DNA的下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述pCAMBIA 3300扩增的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，pCAMBIA3300扩增的下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

其中，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.2反向互补。

2.根据权利要求1所述的真菌表达载体，其特征在于，所述表达载体为绿色荧光蛋白基因gfp和超表达真菌转录调控因子Som1基因融合后插入pBarEx质粒表达载体中构成的组成性表达载体。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的真菌表达载体，其特征在于，用XbaI/BamHI酶切上述真菌超表达载体pBarEx，37℃水浴2小时，将酶切产物进行琼脂糖电泳，出现6kb左右片段，回收6kb左右的片段；以绿僵菌基因组DNA为模板进行扩增得到MaSom1基因的编码序列；以质粒pEGFP-C1为模板进行扩增，得到绿色荧光蛋白基因gfp的编码序列；以上述两个扩增产物为模板，利用绿僵菌基因组DNA的上游扩增引物和质粒pEGFP-C1的下游扩增引物进行融合PCR扩增得到融合基因MaSom1:gfp，回收扩增产物；T4 DNA Ligase 16℃连接XbaI/BamHI酶切的pBarEx和融合PCR产物MaSom1:gfp 6小时左右，转化大肠杆菌感受态，涂布于LB平板上，37℃恒温培养12-16小时，挑取单菌落于液体LB中，37℃250rpm培养12小时，提取质粒DNA，利用XbaI/BamHI酶切提取质粒DNA，切下2.2kb左右的片段，得到pBarEx-Som1:GFP质粒表达载体；

所述绿僵菌基因组DNA的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，绿僵菌基因组DNA的下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述质粒pEGFP-C1的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，质粒pEGFP-C1的下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求3所述的真菌表达载体，其特征在于，琼脂糖电泳过程中，胶质量分数为0.99％。

5.权利要求1-4任一项所述真菌表达载体的构建方法，其特征在于：首先将绿色荧光蛋白基因gfp和超表达真菌转录调控因子Som1基因融合得到融合基因Som1:gfp，再将融合基因Som1:gfp插入pBarEx质粒表达载体，构成组成性表达载体。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述超表达真菌转录调控因子Som1基因采用绿僵菌MaSoml基因，其与绿色荧光蛋白基因gfp进行融合PCR扩增得到融合基因MaSoml:gfp，再将融合基因Som1:gfp插入pBarEx质粒表达载体，构成组成性表达载体；其中融合PCR扩增的模板为MaSoml基因的编码序列和gfp基因的编码序列，上游扩增引物如SEQID NO.5所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.8所示。