[发明专利]检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光RT‑RPA试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物监测技术领域，尤其涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光RT-RPA试剂盒及方法。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的，以水样腹泻、呕吐、脱水为主要临床症状的急性、高度接触性猪肠道传染病，各年龄段猪均可发生，以哺乳仔猪的发病和死亡最为严重， PEDV属于冠状病毒科Alpha冠状病毒属，是一种具有囊膜的、单股正链RNA病毒，PED于1971年在英国猪群中首次报道，然后迅速传播至欧洲和亚洲多个国家，1973年，PED在我国首次发生，并在2010年以前在我国猪群中呈散发性存在，2010年冬季以来，一种高致病性PEDV在我国猪群中开始流行并造成了严重的经济损失，猪群感染高致病性PEDV后，发病率可达100%；在10日龄以下仔猪死亡率可到80-100%，从而对我国养猪业造成了严重的打击，2013年4月底，美国首次爆发PED疫情并迅速蔓延至美国各州，2014年1月底，加拿大首次发生PED，目前，PED对全球养猪业造成了严重的威胁和经济损失。

对PEDV的早期、快速和有效检测是预防和控制PED疫情传播的重要手段之一，目前，已经建立了多种PEDV检测方法，主要包括病毒分离鉴定、间接免疫荧光方法、免疫电镜法和ELISA等传统方法，但是，这些传统方法费时费力、灵敏性较低，随着分子生物学的发展，一系列PCR方法也建立起来，如RT-PCR、纳米颗粒RT-PCR、实时荧光RT-PCR等，但是RT-PCR方法需要精确度高、操作复杂和价格昂贵的PCR仪，并且需要良好的实验室个和熟练的技术人员，因此，RT-PCR系列方法不适合在贫困落后地区装备较差的实验室，更不适合现场检测，目前也建立了多种用于PEDV检测的等温检测方法，主要包括绝缘等温PCR（iiPCR）、RT-LAMP和交叉引物扩增方法（RT-CPA）等，上述等温方法一般需要45-60min才能完成检测，并且RT-LAMP方法需要6条引物，RT-CPA则需要3条引物和2条探针。这些都使得这些方法难以设计，并且需要较长时间才能完成检测。

发明内容

针对现有技术存在的对设备及实验条件要求高，检测时间长，所需引物数量多等问题，本发明提供一种检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光RT-RPA试剂盒及方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种检测猪流行性腹泻病毒的核酸，包括检测猪流行性腹泻病毒的上游引物、下游引物和exo探针，其中，所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述exo探针的序列如SEQ ID No.3所示，其中，所述exo探针的第30位T碱基标记荧光基团，第33位T碱基标记荧光淬灭基团，第32位为脱碱基位点，且原T碱基替换为四氢呋喃，序列信息如表1所示。

表1

进一步地，本发明还提供了所述检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-RPA试剂盒，该实时荧光RT-RPA试剂盒，包括检测猪流行性腹泻病毒的核酸，Trizol 试剂、冻干酶制剂、醋酸镁溶液。

相对于现有技术，本发明提供的检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-RPA试剂盒，操作简单，使用方便，省时省力，该实时荧光RT-RPA试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒，检测效果好，特异性强，灵敏度高，适用性强。

相应地，本发明提供了检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光RT-RPA方法，该实时荧光RT-RPA方法至少包括以下步骤：

（1）从样品中提取RNA；

（2）将步骤（1）中所得的RNA进行等温扩增，将反应体系加入到装有冻干酶制剂的反应管中，补加醋酸镁溶液，于40℃恒温反应20min；

（3）待测样品中有明显的扩增曲线，则判定为阳性；若无明显的扩增曲线，则判定为阴性。

相对于现有技术，本发明的实时荧光RT-RPA方法，操作简便，特异性强，灵敏性高，并且不需要复杂的仪器设备，能够在4-15 min内实现对PEDV阳性样品的快速检测，对于欠发达地区和设备较差实验室的PEDV检测，以及现场PEDV的检测具有重要意义。

附图说明