[发明专利]一种快速鉴定多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗药性的方法及专用引物对

说明书

本发明公开了一种快速鉴定多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗药性的方法及专用引物对。本发明提供了检测多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶B亚基编码基因A1020G位点碱基的物质在检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性中的应用；所述A1020G位点为所述琥珀酸脱氢酶B亚基编码基因中第1020位；所述A1020G位点的碱基为A或G。本发明提供的检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺产生抗药性的点突变的方法，可以用于快速、灵敏地检测田间多主棒孢菌对氟吡菌酰胺的抗性发生发展动态，以便及时调整黄瓜棒孢叶斑病的防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因SdhB的克隆及其在氟吡菌酰胺抗性检测及监测中的应用，具体公开一种快速鉴定多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗药性的方法及专用引物对。

背景技术

近年来，多主棒孢菌(Corynespora cassiicola(Berk.&M.A.Curtis)C.T.Wei)引起的黄瓜棒孢叶斑病在我国黄瓜生产上已由次要病害上升为一种主要病害。田间发病一般减产20％，严重时可达60％～70％。该病害于1906年在欧洲首次报道，1957年美国的北卡罗来纳州报道了该病害的发生，20世纪60年代，戚佩坤等首次在我国报道了该病害的发生。20世纪90年代，房德纯等报道了该病害已成为辽宁省瓦房店市保护地黄瓜主要病害。近年来，在我国辽宁，河北，山东，河南，甘肃等19个省市该病已发展成为主要病害，给黄瓜生产造成严重损失，成为保护地黄瓜生产中亟待解决的叶部病害之一。

多主棒孢菌，隶属于子囊菌门座囊菌纲格孢菌目棒孢科棒孢属，是一种遗传变异性较大的真菌。该均能够侵染植株的叶片、茎秆和根以及线虫的孢囊和人的皮肤，其寄主植物包括380个属的530种植物，包括单子叶、双子叶等。由于该病原菌是一种高度变异的群体，因此在使用抗性品种进行病害控制时存在持效期短的问题。化学防治成为目前是防治该病害最为重要的手段。目前国内外已报道的对黄瓜棒孢叶斑病有效的化学药剂主要包括啶酰菌胺、甲霜灵、氟吡菌酰胺、甲基硫菌灵、嘧菌酯、咪鲜胺、福美双、异菌脲、多菌灵、百菌清、吡唑醚菌酯、代森锰锌、噁唑菌酮及它们的混配制剂及系统性抗病诱导剂苯并噻二唑。其中最具有代表性的是以氟吡菌酰胺和啶酰菌胺为代表的琥珀酸脱氢酶抑制剂(Succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs)。SDHIs是杀菌剂抗性行动协会(FRAC)按照其相似的作用机制和抗性机理新划分出的结构上属酰胺类的杀菌剂。其作用靶标为病原真菌线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)，即复合物Ⅱ或琥珀酸：泛醌氧化还原酶(succinate：ubiquinone oxidoreductase，SQR)。包括氟吡菌酰胺，啶酰菌胺，吡噻菌胺，萎锈灵等共18种杀菌剂。该类杀菌剂由于活性高，杀菌谱广而在全世界范围内被广泛用于农作物病害的防治。

目前，已有14种植物病原真菌报道了对该类杀菌剂的抗性发生，且大部分关于抗性机制报道的文章均将引起病原真菌抗药性的因子锁定在了琥珀酸脱氢酶的B/C/D亚基基因的位点突变上，其中多主棒孢菌对啶酰菌胺的抗药性机制研究表明不同抗性水平的多主棒孢菌，其机制不同。对于超高抗菌株，主要发生SdhB-H278Y(CAC-TAC)突变，对于高抗菌株，主要发生SdhB-H278R(CAC-CGC)突变，对于中抗菌株，抗性突变包括SdhC-S73P(TCG-CCG),SdhD-G109V(GGC-GTC)，SdhD-S89P(TCC-CCC)。