[发明专利]一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法

说明书

技术领域

一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，属于生物检测领域。

背景技术

生物标志物指代表集体结构和功能状态或反映毒物造成机体损伤等生物医学效应的可识别物质。生物标志物具有很高的特异性，生物标志物的有无和含量变化与机体功能状态、疾病的发生发展有着密切的关系，生物标志物的检测为人群筛选、临床诊断、治疗效果、预后观察评价带来有力的分析依据，因此，对生物标志物的检测在及疾病诊断过程中发挥中极其重要的作用。

蛋白质是一类重要的生物标志物，许多肿瘤生物标志物属于酶类、抗原类物质及微球蛋白、铁蛋白等蛋白类物质。目前常用的蛋白检测方法包括放射免疫实验（RIA）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、蛋白免疫印记等方法，虽然这些方法能够实现蛋白质检测和定量，但在一些需要高灵敏的检测领域受到了限制。因此开发高灵敏的生物标志物的检测方法非常重要。

适配体是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选的一类能够识别目标分子的一段单链DNA或RNA分子，是一种新型的生物识别分子，这类分子与目标分子的识别具有高亲和性和高特异性，并且通过体外合成就可以获得，可以进行大量快速的制备，同时适配体分子的稳定性受环境因素的干扰小，稳定性更强，因此被广泛应用于生物传感器领域。当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化，将核酸适配体应用于识别探针可以开发出多种基于核酸适配体的构型变化的传感器。

量子点是由半导体材料(通常由IIB~ⅥA或IIIA~VA元素组成)制成的、稳定直径在2-20 nm的纳米粒子。由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。单纯的量子点颗粒容易受到杂质和晶格缺陷的影响，但是当以其为核心，用另一种半导体材料包裹，形成壳核结构后，不但可以增强产物的稳定性和分散性，还可以将量子产率提高50%，不同粒径的量子点还可以获得从紫外到近红外范围内任意点的光谱。量子点作为生物荧光探针，在生物医药领域具有广泛的应用前景，因为量子点具有优良的光谱特征和光化学稳定性，可以更大的拓宽量子点作为生物探针在生物检测领域的应用范围。

本发明将三种不同发射波长的量子点分别修饰三种不同生物标志物的适配体，适配体与生物标志物的识别作用导致适配体结构发生改变，将其与修饰有三种相对应的适配体互补序列的金纳米粒子混合，未与生物标志物结合的适配体序列与其互补序列杂交成双链结构，从而导致金纳米粒子对量子点的荧光产生淬灭作用，通过测定反应后体系中三种量子点的荧光信号的变化，从而得到每种生物标志物与相对应的荧光强度之间的对应关系，从而分别对每种生物标志物进行检测。

发明内容

要解决的技术问题：现有的生物标志物检测方法在一些需要高灵敏的检测领域已经难以达到检测需求，从而限制了现有方法的使用范围。同时，单一生物标志物的检测无法快速提供疾病的全面信息，因此需要开发多重检测方法用以提高疾病的检测效率。

技术方案：一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，包括如下步骤：

(1)羧基量子点修饰适配体DNA分子

将三种不同的发射波长间隔大于50nm的羧基量子点（购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司）用碳二亚胺法分别修饰三种生物标志物的带有氨基的适配体分子，以一种量子点为例，具体步骤为：用pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液将量子点稀释成10nM的浓度，向200μL50nM的量子点溶液中加入1mg碳二亚胺和2mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温条件下振荡反应1h，然后用截留分子量为1000的超滤管进行超滤，再用pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液将其重悬，从而得到适配体修饰的量子点。

(2)金纳米粒子修饰适配体分子的互补序列

将新合成的粒径为15-20nm的金纳米粒子在8000r/min的条件下离心浓缩5倍，测得金纳米粒子的浓度为10nM，将与步骤（1）中三种适配体对应的三种互补DNA分子等量混合，将其加入到200μL 10nM的金纳米粒子中，使得每种DNA分子的终浓度为200nM，DNA分子与金纳米粒子以20:1的摩尔比进行修饰反应，在室温条件下孵育6h后，将金纳米粒子在9000r/min的条件下离心以去除多余的DNA分子。

(3)荧光淬灭体系的形成以及荧光信号的测定