[发明专利]一种饲料中二氢吡啶的测定方法

说明书

本发明公开了一种饲料中二氢吡啶的测定方法，包括以下步骤：称取粉碎均匀的饲料样品，加入有机溶液提取两遍，合并上清液；经过固相萃取柱净化后，洗脱液收集并定容到一定体积，直接上液相色谱‑质谱/质谱仪进行测定。本方法弥补了目前没有饲料中二氢吡啶检测方法，且操作简单方便、灵敏度高、回收率高，定性定量准确等特点，能满足兽药检测的需求。

【技术领域】：

本发明属于饲料技术领域，具体涉及一种通过高效液相色谱串联质谱仪测定饲料中的二氢吡啶的方法。

【背景技术】：

二氢吡啶，淡黄色粉末或针状结晶，无毒，无味，遇光变色，易氧化，能溶于热乙醇，微溶于水。是农业部首次批准在我国使用的兽药类促生长添加剂，被列入农业部《兽药质量标准》2003年版中。

据报道二氢吡啶是一种新型绿色多功能的饲料添加剂，具有促进动物生长、改善皮毛质量、提高瘦肉率、提高繁殖性能及防病抗病等广泛的生物学功能。同时报道称二氢吡啶通过胃肠吸收，97％～99％随排泄物中排除，在其它器官和组织中很少存留，对动物不产生突变和胚胎中毒等优点。

虽然二氢吡啶在具有多种功能，但是其使用量是受到限制的，在《兽药国家标准》2017年版中规定每1000kg饲料中，牛允许使用量为100g-150g，种肉鸡为150g，牛和肉鸡的休药期均为7天，弃奶期为7天。在2017年315晚会中曝光了一些饲料企业为了追求利益最大化，大量添加促生长药物，其中就包括二氢吡啶，但是目前还没有测定饲料中二氢吡啶的方法。

【发明内容】：

本发明的目的是提供一种测定饲料中二氢吡啶的方法，弥补目前没有二氢吡啶检测方法的情况。本发明通过高效液相色谱串联质谱法测定饲料中的二氢吡啶含量，该方法操作简单方便、灵敏度高、回收率高，定性定量准确等特点，能满足兽药检测的需求。

为实现上述目的，本发明采取以下检测步骤包括：

1、样品提取：

准确称取粉碎均匀的饲料样品2g，精确至0.01g，置于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入10mL有机溶液，于旋涡混合器上涡旋1min，超声提取10min，6000转/min离心5min，收集上清液于另一个50mL离心管中。残渣另加入10mL有机溶液，重复上述提取步骤，合并上清液，待净化。

2、固相萃取柱净化

取部分上清液用水稀释一定的倍数，将稀释液全部过固相萃取柱净化，用水淋洗，吹干，并用3mL有机洗脱液进行洗脱，用水定容至5mL，过0.22μm有机滤膜，转移至进样小瓶，形成待测液待测。

3、液相色谱串联质谱测定

建立液相条件和质谱条件，按照相应条件测定标准工作溶液和待测液。通过保留时间和离子丰度比进行定性分析，采用外标标准曲线法进行定量分析。

作为优选，在步骤1中所述有机溶液为40％乙醇溶液。

作为优选，在步骤2中所述稀释一定的倍数，原则是将乙醇溶液稀释到10％一下，如取2mL上清液，定容至10mL。

作为优选，在步骤2中所述固相萃取柱为Thermo PEP固相萃取柱，规格为500mg/6mL(先用甲醇、水各5mL活化再使用)。

作为优选，在步骤2中所述有机洗脱液为乙腈。

作为优选，在步骤3中所述液相分析条件为：

a)色谱柱：BEH C18柱，2.1×50mm，1.7μm；

b)流动相：流动相A：甲醇；流动相B：5mmol/L乙酸铵和0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序为0～1min，70％～60％A；1～3min，60％～30％A；3～3.5min，30％～10％A；3.5～4min，10％～10％A；4～5min，10％～70％A；