[发明专利]一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法

说明书

本发明涉及一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，属于细胞分离培养技术领域。本发明将3日龄内的离体树鼩大脑放入预冷的含2%双抗的D‑Hank's液中，去除软膜血管，剥离出大脑皮质及中脑组织，用D‑Hank's液清洗后，剪碎，离心，弃上清，胰酶消化后，过细胞筛，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞，转入PDL包被的细胞板上培养，培养3d后换液，以后每3天换一次液；当细胞贴壁并长至70%‑80%时，进行酪氨酸羟化酶及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定。利用本方法分离培养出的神经元细胞成活率高达95%，能为进一步的神经系统疾病的研究提供可靠的实验材料。

技术领域

本发明属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法。

背景技术

神经细胞不具有再生功能，但神经元细胞可以自我更新，能够促进神经细胞再生和神经组织修复，目前神经元细胞难以分离培养。神经性疾病如帕金森综合征、毒品依赖性疾病等会作用于多巴胺能神经细胞，因此找到一种高效分离培养及鉴定多巴胺能神经元细胞的方法是非常必要的。树鼩是一种新型的模式动物，全基因组研究发现它的代谢、神经及免疫系统与人类有着较为高度的同源性，是研究神经系统疾病较好的模型。本发明选用新生树鼩为动物模型，分离培养出具有多巴胺能神经元活性的细胞，从而为进一步的神经系统疾病的研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，该方法利用胰酶消化法分离树鼩神经元细胞，细胞活性较高，能够分离出多巴胺能神经元，为进一步的神经系统疾病的研究奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种树鼩多巴胺能神经元细胞分离培养方法，包括如下步骤：

步骤（1），将3日龄内的离体树鼩大脑放入4℃的含体积浓度为2%双抗的D-Hank's液中，去除软膜血管，剥离出大脑皮质及中脑组织，用D-Hank's液清洗后，将组织剪碎至0.9~1.1mm大小，离心，弃上清，按照体积1:3比例加入0.25%胰酶消化液（即离心管中剩余物与0.25%胰酶消化液的体积比为1:3），于细胞培养瓶中，反复吹打并于37℃、5%CO₂条件下消化；

步骤（2），待步骤（1）消化结束后，向细胞培养瓶中加入细胞培养液终止消化，反复吹打消化后的细胞直至无肉眼可见的组织块，之后采用70目细胞筛过滤，滤液离心，弃上清，用神经元专用培养基重悬细胞并转入0.1mg/ml PDL包被的细胞板上培养，细胞板中细胞含量为1×10⁶cell/孔，培养3d后换液，更换为新的神经元专用培养基，以后每3天换一次液，得到树鼩多巴胺能神经元细胞；当细胞贴壁并长至汇合度为70%-80%时，进行酪氨酸羟化酶及Nestin蛋白的双荧光免疫鉴定；

所述的细胞培养液为高糖DMEM细胞培养基+5%FBS+1%双抗；

所述的神经元专用培养基为neurbasal培养基+ 2%B27+1%Glutamax^TM+ 1%双抗。

进一步，优选的是，步骤（1）所述的离心速度为2500~3000转/分，离心时间5~10分钟；

进一步，优选的是，步骤（1）中，采用眼科剪将组织剪碎；

进一步，优选的是，步骤（1）中，所述的消化的消化时间15~20分钟；

进一步，优选的是，步骤（2）所述的离心速度为2500~3000转/分，离心时间10~15分钟。

利用本发明方法，神经元细胞分离1天后贴壁生长，7天后经免疫双荧光鉴定为具有多巴胺能活性的神经元细胞。

本发明利用胰酶消化法分离树鼩神经元细胞，细胞活性较高，能够分离出多巴胺能神经元。