[发明专利]一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用

说明书

本发明公开一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用，所述四环素慢病毒诱导表达载体包含目的基因表达框和反义四环素转录激活因子表达框；诱导型CRISPR/Cas9系统将Cas9蛋白置于诱导型启动子的下游，并将U6启动表达的sgRNA序列置于整个四环素诱导体系的上游。本发明首次提出TRE3Gp与TetON3G的组合效果最佳，该诱导体系引入细胞后可在保持低背景表达的同时，最大水平的诱导表达目的基因。该诱导系统对诱导剂反应灵敏、效率高、分子量小，可广泛应用于基因功能研究中。

技术领域

本发明涉及功能基因组学研究领域，主要涉及一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用。

背景技术

基因的调控表达可以使基因功能的研究更为精细。1992年Gossen等成功地利用原核基因调控元件构建了四环素(tetracycline,Tet)真核细胞基因表达调控系统，利用Tet或其衍生物对所感兴趣的基因进行诱导表达。四环素诱导系统包括Tet-off和Tet-on系统，其中Tet-on系统利用反义四环素转录激活因子(rtTA)，在无诱导物多西霉素(Doxycycline，Dox)的条件下处于关闭状态，只有在Dox刺激下才能快速诱导目的基因表达，因而Tet-on系统更受人们青睐(Gossen M，Freundlieb S et al，Science，1995)。随着人们对该系统的不断改进，使诱导表达具有严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点，已广泛应用于基因功能研究和基因治疗研究。Urlinger等通过密码子优化、剪切位点移除及VP16激活区的引入等一些列手段开发出了第二代反义四环素转录激活因子蛋白rtTA2s-M2，显著地提高了诱导系统对Dox的敏感性与诱导效率(Urlinger S，Baron U et al，ProcNatl Acad Sci，2000)。pTRIPZ(ThermoFisher)载体是基于rtTA2s-M2突变生成的rtTA3变体而开发出来的一个商业化载体，rtTA3变体能在保持二代rtTA2s-M2体系本底不变的同时，将诱导水平提高五倍，并显著提高系统对诱导物Dox的敏感性(Das AT，Zhou X et al，Journal of Biological Chemistry，2004)。Zhou等通过将四环素诱导系统引入到HIV病毒基因组中，通过突变筛选出具有更优诱导倍数的rtTA蛋白(Zhou X，Vink M et al，GeneTher，2006)。

尽管四环素诱导系统得以长足发展，但依赖于慢病毒载体的Tet-On体系还不够完善，这是因为源于慢病毒载体的LTR启动子/增强子会造成表达泄露现象，尤其是在构建同一载体共表达诱导基因和rtTA时，更需要优化最佳组合方式。Clontech公司研发的Lenti-XTet-One Inducible Expression System是在lentivirus载体上正向插入了PKG启动子控制下的Tet-On 3G和反向插入的TRE3Gs诱导性启动子及下游目的基因。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用，发明人经研究系统性比较了诱导型慢病毒表达载体上的各个元件及其组合对Tet-on系统的诱导效率及本底表达水平的影响，并将CRISPR/Cas9体系引入到新建立的四环素慢病毒诱导系统中，旨在建立一种更高效的诱导型慢病毒表达体系和更优秀的CRISPR/Cas9系统。

本发明的技术方案如下：

一种四环素慢病毒诱导表达载体，其中，所述四环素慢病毒诱导表达载体包含目的基因表达框和反义四环素转录激活因子(rtTA)表达框；目的基因表达框包括四环素诱导型启动子及目的基因；反义四环素转录激活因子表达框包括组成型启动子、反义四环素转录激活因子、连接肽以及筛选标记基因；诱导型CRISPR/Cas9系统将Cas9蛋白置于诱导型启动子的下游，并将U6启动表达的sgRNA序列置于整个四环素诱导体系的上游。

所述的四环素慢病毒诱导表达载体，其中，诱导型启动子选用TRE3Gp、TRE3Gs或TetO6。