[发明专利]木聚糖酶突变体

说明书

本发明涉及蛋白质工程改造技术领域，特别涉及耐热性得到提高的木聚糖酶突变体。本发明通过定点突变的方法在木聚糖酶中人为引入两个或三个非自然二硫桥，获得了耐热性提高的突变体XynA1和XynA2，尤其是引入三个二硫桥的突变体XynA2，其在80℃处理5min后酶活残留率高达75％，比突变体XynA1的酶活残留率提高了72％。本发明进一步筛选获得三个能显著提高突变体耐热性的突变位点Q51N，H143K，Q161F，所述突变位点以单点或两点组合或三点组合的方式引入木聚糖酶XynA1和XynA2，均能有效提高其耐热性。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程改造技术领域，特别涉及耐热性得到提高的木聚糖酶突变体。

背景技术

木聚糖是植物半纤维素的主要组成部分，广泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等 农作物废弃物中，由于木聚糖酶能够将木聚糖分解成不同长度的低聚木糖和木糖，该产物 具有重要的经济价值，通过木聚糖酶将这些可利用资源充分利用，发挥其潜在的应用价值， 木聚糖酶的研究也受到充分的重视。

木聚糖酶是水解β-1，4-连接的吡喃木糖苷链的糖基水解酶，已被证明存在于至少上 百种不同生物体中，并可以经济地大规模生产。它们与其他糖基水解酶一起形成了包括超 过40中不同酶家族的超家族。已知里氏木霉可以生产三种不同的木聚糖酶，其中木聚糖酶I和II(XynI和XynII)具有最好的特点。XynI分子量19kDa，与XynII相比，它的等 电点和最适pH较低(pI 5.5，pH 3-4)。XynII分子量20kDa，它的等电点为9.0，最适pH 5.0-5.5。

现在木聚糖酶被广泛应用于纸浆漂白、纺织品纤维修饰以及在动物饲料和人类的食品 生产中。所有这些应用中的共同问题是木聚糖酶面临的极端条件。在工业应用中的高温以 及与许多木聚糖酶的最适pH与工业应用中的pH条件不同，降低了现有木聚糖酶在工业上 的有效利用。

在应用于纸浆漂白过程中，来自于碱洗的物料具有较高的温度(80℃)和pH(10)。 多数木聚糖酶在这样的条件下将会失活，因此必须将纸浆冷却，将碱性中和，但这意味着 成本的增加。

在饲料应用中，木聚糖酶面临着饲料制备期间的短暂高温(如90℃下2-5分钟)。但是， 木聚糖酶的催化活性需要的温度较低(如约37℃)。这样，木聚糖酶将在高温下不可逆地 失活。

尽管已有大量研究改善了木聚糖酶的稳定性，但仍不能满足日益提高的工业生产需求， 因此，提供一种适用于工业生产的耐高温木聚糖酶具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种木聚糖酶突变体，获得突变体蛋白，提高其耐热性，从而 有利于木聚糖酶在饲料领域的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种木聚糖酶突变体，其包括二硫桥，所述二硫桥包括T1C-T27C、Q33C-T187C或S109C-N153C(木聚糖酶编号方式)中的一个或多个；

且其具有(I)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(I)与木聚糖酶酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的序列；

(Ⅱ)具有所述木聚糖酶的至少一个免疫表位，且所述木聚糖酶的氨基酸序列SEQID NO:1经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

(Ⅲ)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与 如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序 列；

所述取代为第51位、第143位或第161位的一个或多个氨基酸被取代。

在一些实施例中，本发明提供的木聚糖酶突变体的氨基酸序列与木聚糖酶的氨基酸序 列具有至少96％同源性。