[发明专利]一种烟草腋芽生长调控基因NtMOC1及其克隆方法与应用

权利要求书

1.一种烟草腋芽生长调控基因NtMOC1，其特征在于所述烟草腋芽生长调控基因NtMOC1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述烟草腋芽生长调控基因NtMOC1的克隆方法包括以下步骤：

A、确定NtMOC1基因序列；

根据GenBank 登录号 XP_015642672.1的水稻MOC1基因蛋白序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMOC1序列，利用此序列设计基因克隆引物：

正向引物：5’-GGTACCATGTTAGGATCCTTTGGTTC-3’；

反向引物：5’-CTCGAGTTAACGCCAAGAAGATATGG-3’；

B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtMOC1基因序列设计合成特异性引物，所述特异性引物为：正向引物：5’-GGTACCATGTTAGGATCCTTTGGTTC-3’，反向引物：5’-CTCGAGTTAACGCCAAGAAGATATGG-3’；以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion^® High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL，PCR反应在Mastercycler^® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；

D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR^®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。

2.根据权利要求1所述的烟草腋芽生长调控基因NtMOC1，其特征在于D步骤中所述培养基配方及制备方法是称取胰蛋白胨8~12g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸馏水中，121℃灭菌25min得到。

3.一种权利要求1所述烟草腋芽生长调控基因NtMOC1的应用，其特征在于所述烟草腋芽生长调控基因NtMOC1在用于获得打顶后烟草产生腋芽的长度和重量显著降低的转基因植株中的应用。