[发明专利]一种基于G-四联体核酸适配体荧光探针检测牛奶中环丙氨嗪的方法

说明书

本发明公开了一种基于G‑四联体核酸适配体荧光探针检测牛奶中环丙氨嗪的方法。当检测体系中没有环丙氨嗪时，修饰在适配体上的荧光素FAM会在520nm处释放出荧光；当体系中加入环丙氨嗪后，环丙氨嗪和功能核酸上的胸腺嘧啶结合，促进功能核酸形成G‑四联体结构，抑制了520nm处的荧光释放，基于释放出的荧光信号与环丙氨嗪浓度呈反比，通过测定荧光信号可实现牛奶中环丙氨嗪的定量检测。本方法可用于牛奶中环丙氨嗪的检测，检测灵敏度高，最低检测限0.68ppb，选择性好，操作简便，前处理简单，不需要大型仪器。

技术领域

本发明属于环丙氨嗪检测技术领域，特别涉及一种基于G-四联体核酸适配体荧光探针检测牛奶中环丙氨嗪的方法。

背景技术

环丙氨嗪(Cyromazine，Cyr)的化学名为2-环丙胺基-4，6-二氨基三嗪，与阿特拉津、西玛津、莠灭津、扑灭津等同属三嗪类或均三氮苯化合物，是一种高效抑制昆虫生长剂、杀寄生虫类杀虫剂，在畜禽养殖过程中作为饲料添加剂使用。研究表明环丙氨嗪进入动物体内绝大部分以原药或代谢物形式通过奶或者粪尿排泄，随后再经由畜禽粪便暴露在土壤和水环境中。土壤或水环境中的环丙氨嗪通过环境转归再次进入食物链，对不同营养级生物和人体的健康造成潜在隐患。环丙氨嗪在动物和植物体内经脱烷基化作用代谢为三聚氰胺(Melamine，Mel)，而三聚氰胺的主要代谢产物为三聚氰酸(Cyanuric acid，CA)、三聚氰酸一酰胺(Ammelide，Amd)和三聚氰酸二酰胺(Ammeline，Amn)。长期涉入三聚氰胺会导致膀胱结石，膀胱癌的发生率明显提高。

对牛奶中环丙氨嗪及其代谢产物的快速检测，可以有效避免有毒有害物质进入人体。环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺是一组分子量小、且极性强的化合物，要想将环丙氨嗪及其相关代谢物从实际样品中提取出来非常困难。美国EPA严格规定了环丙氨嗪必须作为饲料添加剂且只能放置在厩舍喂饲槽中使用，但仍有通喷洒用于饲养场所、堆肥、垃圾等处的灭蝇。环丙氨嗪经动物口服后绝大部分以原药或代谢产物三聚氰胺形式经动物尿粪排泄，在动物体内残留很少。美国EPA和PRC制定了环丙氨嗪在一系列动植物食品中的最高残留标准，其中牛奶为0.05mg/kg。

根据环丙氨嗪及其代谢产物三聚氰胺在食品中的限量标准要求，目前常用于环丙氨嗪及其代谢产物残留检测的方法有容量分析法；色谱分析方法，包括高效液相色谱法；免疫化学分析法；光学分析法等。在GB 29704-2013中采用超高效液相色谱-串联质谱法来测定动物性食品中环丙氨嗪的残留。随着环丙氨嗪类兽药残留检测列入生乳收购及乳制品产品出厂必检项目，而由于上述检测方法和条件的限制，面对庞大的检测数量会导致成本巨大且工作量重，难以满足现场快速检测的需求，这就在客观上要求改进现有的检测方法，开发出高通量、快速、高灵敏的环丙氨嗪检测方法，用于日常监控。

核酸适配体是通过指数富集配体系统体外进化(SELEX)技术，从大量寡聚核苷酸库中筛选出对靶物质具有高特异性和高结核性的核酸片段。但与蛋白质类抗体和生物酶相比，核酸适配体具有更高的亲和力、稳定性和特异性，且易于标记设计出传感器，已经用于核酸、蛋白、无机金属离子及病毒颗粒和细胞的检测。尽管胸腺嘧啶可以与环丙氨嗪的代谢产物三聚氰胺通过氢键结合已有报道，但可与环丙氨嗪特异性结合形成G-四联体的适配体还未有筛选或合成出来，并且基于此使用荧光分光光度计用于检测也未见报道。

发明内容

本发明的目的是利用不同浓度的环丙氨嗪可以不同程度的淬灭检测液中荧光素的荧光强度的现象，提供一种灵敏度高、选择性好、成本低的牛奶中环丙氨嗪的检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种利用荧光素FAM修饰的可形成G-四联体的核酸适配体检测液检测牛奶中环丙氨嗪的方法。荧光素FAM修饰在核酸适配体的5’端，形成稳定检测液，在激发光波长为480nm时，会在520nm处释放出稳定的荧光。