[发明专利]一种基于微滴数字PCR方法快速定量筛查生菜中蜡样芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品微生物鉴定与应用技术领域，具体涉及即食生鲜果蔬生菜中蜡样芽孢杆菌的DNA提取及微滴数字PCR快速定量筛查方法。

背景技术

即食生鲜蔬菜和水果是食源性致病菌传播的主要载体之一。目前，质检总局将食品安全的风险监测列入了民生民计的重大解决问题，影响食品安全的因素有很多，而其中由微生物危害导致的食品安全问题达到了总量的40％。当前中国在食源性病原菌微生物方面面临着严峻的挑战，急需对潜在危害做出合理的风险评估，化被动为主动将危害控制在可接受水平。而目前微生物定量监测的技术手段主要为传统培养法，费时费力，辅助的实时荧光定量PCR方法，虽在时间上有了很大突破，但其定量结果的准确性要依赖于标准曲线构建的准确性和引物的扩增效率，而微滴数字PCR技术在食源性病原菌上的应用，弥补了这一缺陷。

微滴数字PCR技术作为第三代PCR技术，是在传统PCR方法基础上采用一种全新的方式进行核酸分子的定量，与实时荧光定量PCR相比，无需构建标准曲线，不受扩增效率的影响，其结果具有更高的精确度、准确性和灵敏度。微滴数字PCR的核心是能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数，以绝对定量的方式直接“数”出靶分子的个数。

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种兼性需氧的革兰氏阳性菌，广泛分布于土壤、空气和污水中，在各类生熟食品中也常见。炒米饭、牛奶和肉类制品等是其主要污染对象，该菌1950年首次在挪威报告会引起食物中毒，目前已被挪威和荷兰认定为食品中最容易检出的食源性致病微生物。在我国，蜡样芽孢杆菌也是常见的食源性致病菌之一，其所致中毒症状主要表现为呕吐和腹泻，引起的中毒事件往往比较严重。根据我国食品污染物和食源性疾病监测网络在2003年的统计，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4.0％，为细菌性食物中毒的第四位。蜡样芽孢杆菌传统培养法是目前常用检测方法，但其检测蜡样芽孢杆菌的检验程序复杂繁琐、耗时费力，全过程需至少4～7d，才能得出明确的诊断结果。因而，建立一种准确快速的定量检测蜡样芽孢杆菌的方法一直是研究的热点，而微滴数字PCR的应用解决了这一难题，并填补了微滴数字PCR技术在蜡样芽孢杆菌定量检测上的空白。

研究表明，蜡样芽孢杆菌的gyrb毒力基因与蜡样芽孢杆菌的致病性密切相关，因此在前人研究的基础上根据gyrb毒力基因序列合成特异性引物和TaqMan探针，通过特异性、灵敏度等试验的优化摸索，建立微滴数字PCR蜡样芽孢杆菌快速定量检测方法，以其克服传统致病微生物检测方法的诸多不便，并与传统国家标准方法进行比较，为蜡样芽孢杆菌定量检测开辟了新的技术领域。

发明内容

本发明的目的在于在大样本定量筛查即食生鲜生菜中的蜡样芽孢杆菌时能够快速、简便的得到筛查结果，在第一时间控制食源性致病菌的蔓延，为食品安全突发事件争取有效的时间。本发明的快速筛查方法具有高效、快速、精准、量化、操作简便等优势。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种基于微滴数字PCR方法快速定量筛查生菜中蜡样芽孢杆菌的方法，其特征在于它按如下步骤进行：

(1)参照国标GB4789方法称取生菜样品25.0g放入带滤膜的均质袋中，再加入225mL磷酸盐缓冲液，制成1:10的稀释液，用均质器充分均质；

(2)取1:10的稀释液1mL(或根据样品带菌情况富集离心)，13200rpm，离心10min，弃上清，沉淀应用硅胶柱试剂盒法提取生菜细菌DNA；

(3)采用微滴数字PCR扩增引物及探针引物，对蜡样芽孢杆菌的DNA进行扩增；