[发明专利]检测片状边虫的引物对、套组及方法

说明书

【技术领域】

本申请系关于一种片状边虫的快速诊断，尤指一种检测片状边虫的引物对、套组及方法。

【现有技术】

片状边虫(Anaplasma platys，旧名为Ehrlichia platys)，或称扁形边虫，是造成热带及温暖地区之犬周期性血小板减少症(canine cyclic thrombocytopenia)之病原虫，其分布在地中海区域、亚洲、中东、非洲、澳洲及美国。犬边虫症(canine anaplasmosis)为一种广泛散播的疾病，因此又称为犬只急重症(canine emerging disease)，而棕色犬壁虱(brown dog tick，学名为Rhipicephalus sanguineus)及革蜱属(Dermacentor spp.)被认为是传播此病原虫的媒介。片状边虫是目前所知唯一感染血小板的立克次体，其生物体在血小板中呈圆形、椭圆形或豆形的蓝色细胞包涵体，且径长介于0.35至1.25μm之间。

片状边虫感染的症状包含发烧、食欲不振、嗜睡、因病原虫破坏宿主血小板细胞造成的初级凝血异常、中度贫血、及淋巴结肿大，且菌血症及接续的血小板低下症(血小板数量低于20,000/μl)会在间隔一到两周的时间复发。若是与犬艾利希体(Ehrlichia.canis)共同感染，将可能导致更严重的病症。

目前用于片状边虫诊断的方法包括血液抹片、血清诊断及分子诊断，但前述方法皆有其限制。

片状边虫的诊断可透过镜检染色的血液抹片或血液棕黄层(buffy coat)抹片(例如Giemsa染色法或Diff-Quik染色法)来辨识血小板中的病原虫。然而，由于为循环的寄生虫血病(cyclic parasitemia)，病原虫可能不存在或是以非常低的数量存在血液抹片上，因此这个方法是不可靠的，且灵敏度低及费时。

血清诊断则有助于辨识片状边虫抗体的存在，但可能无法侦测出疾病急性期的早期感染。血清诊断的限制更在于交叉反应，尤其常见于艾利希体属(Ehrlichia spp.)及边虫属(Anaplasma spp.)之间。此外，血清诊断也无法区分出是曾经感染(post exposure)或是正在感染(present infection)。

而诊断片状边虫最佳的方式便是分子诊断，尤其是利用聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)进行检测。聚合酶连锁反应是一种更灵敏且更具专一性的技术，提供了诊断边虫症(anaplasmosis)的另一替代方案，而16S rRNA的基因序列即被用来分辨各种种类的边虫。举例而言，由BioinGentech公司所提供的片状边虫检测套组(VetPCR A.platys Detection Kit)可用来检测片状边虫感染，且诊断快速、准确及可靠。然而，此检测套组仍需结合终端PCR侦测方法，例如凝胶电泳(gel electrophoresis)，使得整个检测过程需花费3小时，仍是相当费时及费力。

因此，提供一种可改善现有技术缺点之片状边虫诊断方法实为本领域之人士需要努力的方向。

【发明内容】

本案的目的在于提供一种用以检测片状边虫(Anaplasma platys)的引物对，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出片状边虫感染。

本案的另一目的在于提供一种用以检测片状边虫(Anaplasma platys)的套组，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出片状边虫感染。

本案的又一目的在于提供一种用以检测片状边虫(Anaplasma platys)的方法，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出片状边虫感染。

为达上述目的，本申请之一较广义实施方案为提供一种用以检测片状边虫(Anaplasma platys)的引物对，包含一顺向引物及一逆向引物，其中，该顺向引物的序列为5’-GTCGTAGCTTGCTATGATA-3’，该逆向引物的序列为5’-CCATACTACTAGGTAGATTCC-3’。该顺向引物及该逆向引物系用于实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)。