[发明专利]用于标记SNAP-tag的蛋白标签荧光探针

说明书

本发明一种具有特异快速标记能力的SNAP‐tag蛋白标签荧光探针，该荧光探针以4‐氨基‐1,8‐萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，该荧光探针结构如式(1)所示，本探针基于环境敏感型荧光团萘酰亚胺衍生得到，能够特异性与SNAP‐tag蛋白反应，并且反应后荧光强度增加12倍。在荧光增强型SNAP‐tag荧光探针中，其反应速率达到了14436±1189M^‐1s^‐1，与商品化的需要细胞洗脱步骤的荧光底物速度相当，是目前报道的荧光增强型SNAP‐tag荧光探针中标记速度最快的。该探针能够在活细胞内短时间对融合有SNAP‐tag标签的目标蛋白进行特异性标记，实现免洗荧光成像。该探针能够在蛋白标记、蛋白识别、蛋白与小分子/大分子的相互作用，以及细胞荧光成像等领域得到广泛应用。

技术领域

本发明属荧光成像技术领域，特别涉及一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针。

背景技术

荧光成像技术已经逐渐成为在细胞层次到个体水平研究蛋白质功能的强有力工具。由于具有尺寸小、荧光发射光谱宽泛、可选择荧光颜色多样等优点，在蛋白标记领域有机小分子荧光染料逐渐成为荧光蛋白的替代者。但是有机小分子染料是外源物种，存在的问题是不能够像荧光蛋白一样由细胞源生，所以无法控制在细胞中的数量以及细胞中的位置。为了解决这个问题，化学家发展了多种生物正交的方法将小分子染料共价连接到目标蛋白上，从而可以进一步跟踪研究目标蛋白的位置和功能。其中，目前应用最广泛的是蛋白标签技术，该技术通过遗传编码的方法首先将标签蛋白融合到目标蛋白上，然后这种蛋白标签与荧光底物发生专一的酶促共价连接反应，从而实现将小分子荧光染料连接到目标蛋白的目的。利用蛋白标签技术实现活细胞蛋白成像时，荧光底物需要满足多种性能要求，至少包括荧光底物具有良好的细胞透膜性、与蛋白标签意外的生物大分子无结合，与蛋白标签反应快、蛋白标记前后荧光有明显变化以提高信噪比等。其中，自由的荧光染料无荧光或很弱，与蛋白标签标记后荧光显著增强，这样的荧光信号能够有效避开背景荧光以及没有反应的荧光底物的干扰，这个性能对于活细胞成像时至关重要，可以省掉多次洗细胞这样的有损细胞的操作。

目前获得广泛应用的蛋白标签是SNAP-tag与Halo-tag。其中SNAP-tag是对由207个氨基酸组成的DNA修复蛋白酶(O⁶-鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，hAGT)进行突变改造而获得的，其标记原理是作为反应位点的半胱氨酸能够与O⁶修饰的苯甲基鸟嘌呤进行亲核反应脱去鸟嘌呤，使得半胱氨酸与苄基形成稳定的硫醚键，而荧光底物连接在苄基对位，从而实现以共价键形式与荧光底物高特异性的连接。通过有机合成可以将多种多样的有机小分子荧光探针引入苄基，从而获得多种SNAP-tag的荧光探针。

由于SNAP-tag的广泛应用，相应的荧光探针已有报道，并且部分荧光探针已经商品化。商品化SNAP-tag荧光底物主要是通过较长的链将荧光团(如罗丹明、菁染料等)连接在苯甲基鸟嘌呤上，标记反应速度快，缺点是与SNAP-tag标记前后荧光没有显著变化，细胞成像时必须洗脱出去没有反应或者定位不准确的荧光底物。目前已经报道了几种荧光探针能够在与SNAP-tag连接后引起荧光的显著增强变化，可以用于免洗细胞成像，但是这些探针的缺点是反应速度慢，与商品化的比较速度慢1-2个数量级。因此，开发反应速度快，并且与SNAP-tag标记前后有明显荧光变化的荧光底物显得迫切和需要。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的提供一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针及其制备方法和应用。

一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针，以4-氨基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，该荧光探针具有如下结构：