[发明专利]荧光定量检测百日咳博特氏菌的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及荧光定量检测百日咳博特氏菌的试剂盒和方法。

背景技术

百日咳是由百日咳博德特氏菌引起的急性呼吸道传染病。其临床特征为阵发性痉挛性咳嗽并伴有深长的“鸡鸣”样吸气性吼声，如未得到及时有效治疗，病程可达数个月。本病传染性很强，患儿年龄越小，病情越重，可因并发肺炎、脑病而死亡。

大多数情况(80-98％)是由小的革兰氏阴性细菌百日咳博德特氏菌(B.pertussis)引起的，然而少数情况(2-20％)是由副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)引起的(Mattoo etc.2005)。由副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)引起的百日咳的症状一般地比由百日咳博德特氏菌(B.pertussis)引起的要温和，然而，仅仅基于临床症侯学差别诊断是困难的。极少的是类似百日咳的症状，其由支气管败血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)或霍氏博德特氏菌(B.holmesii)感染所引起的。

市面上流通的基于荧光定量方法检测百日咳博德特氏菌的试剂盒一般采用IS481，ptxS1基因序列作为靶标序列，但IS481基因序列同时存在于百日咳博德特氏菌、霍氏博德特氏菌和支气管败血博特氏菌中(Karen B etc.2006)，ptxS1基因序列同时存在于百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌中(Fengxiang Gao etc.2013)，所以这些试剂盒并不能专一检测百日咳博德特氏菌。有人应用IS481和IS1001基因序列组合来检测百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌，但该组合需要两个反应来完成检测，这样加重了检测成本。

发明内容

本发明的一个目的是提供检测百日咳博特氏菌荧光定量试剂。

本发明提供的试剂，包括检测百日咳博德特氏菌的引物1、检测百日咳博德特氏菌的引物2、检测百日咳博德特氏菌的探针1；

所述引物1的核苷酸序列为序列2；

所述引物2的核苷酸序列为序列3；

所述探针1的核苷酸序列为序列4。

上述试剂中，所述试剂还包括内标荧光探针2，所述内标荧光探针2的核苷酸序列为序列6。

上述试剂中，所述各个探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。

上述试剂中，所述引物1、所述引物2、所述探针1和所述探针2的摩尔比为2:2:1:1。

本发明第二个目的是提供检测百日咳博特氏菌荧光定量PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括上述试剂；

所述各引物在所述PCR试剂中的浓度为0.4uM；

所述各探针在所述PCR试剂中的浓度为0.2uM。

含有上述试剂或上述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

试剂盒中还可以包括百日咳博德特氏菌的标准品、内标、阳性对照品、阴性对照品组成。

百日咳博德特氏菌标准品为将序列1所示的百日咳博德特氏菌序列与pGEM-T载体(Promega，产品编号A362A)连接，得到百日咳博德特氏菌质粒，即为标准品。

内标：为将序列5所示的内标序列与pGEM-T载体连接，得到内标质粒，即为内标。

阳性对照品为灭活的百日咳博特氏菌的DNA提取物；

阴性对照品为正常人的痰液提取液(提取方法同前)。

上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在检测或定量检测百日咳博德特氏菌中的应用也是本发明保护的范围；

或上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测或定量检测百日咳博德特氏菌产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测待测样本是否感染百日咳博德特氏菌产品中的应用也是本发明保护的范围。

若要定量检测，可以通过检测5个浓度梯度定量参考品(标准品)的Ct值大小，并用该5个浓度梯度定量参考品(标准品)的Ct值大小和5个浓度梯度绘制的标准曲线，将待测样本的ct值带入该标准曲线中，得到待测样本的定量检测结果；

本发明第3个目的是提供一种检测待测样本是否感染百日咳博德特氏菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述PCR试剂对待测样本进行实时荧光定量PCR，

若待测样本的实时荧光定量PCR结果为如下条件：在测定百日咳博德特氏菌的通道下扩增曲线呈S型或Ct值≤39且Ct值＞0，则待测样本感染或候选感染百日咳博德特氏菌；

若待测样本的实时荧光定量PCR结果不为所述条件，则待测样本不感染或候选不感染百日咳博德特氏菌。