[发明专利]一组伯克氏菌同源重组酶及其表达载体与应用

权利要求书

1.一组能够高效介导伯克氏菌体内重组发生的同源重组酶与来源于E.coli双链DNA核酸外切酶抑制蛋白Redγ结合在提高伯克氏菌体内重组效率中的应用，其特征在于，应用方法是：

(1)以广宿主的复制子pBBR1为基础，构建包含pBBR1复制起点、卡那霉素抗性基因(km^R)、鼠李糖诱导型启动子(P_Rha)和受鼠李糖诱导型启动子控制表达的重组酶Redγ-E.coli/Redβ-7029/Redα-7029的带有Redα/Redβ7029同源重组酶与E.coli双链DNA核酸外切酶抑制蛋白Redγ的重组酶表达载体，命名为pBBR1-Rha–RedG-BA 7029–Km，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述Redα7029的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Redβ7029的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

(2)对感受态细胞制备方法优化，DNA转化量优化，抗生素选择浓度优化，同源臂长度优化，确定最佳的工作条件为：初始OD值为0.1的DSM 7029菌液，30℃，950rpm培养14小时后，添加体积比2％的10mg ml^-1鼠李糖溶液，30℃，950rpm，诱导1.5h，用常温的双蒸去离子水处理感受态细胞并在常温进行电转化；

(3)在优化的工作条件下，在伯克氏菌DSM 7029(Polyangium brachysporum strainDSM 7029)中进行基因替代，基因同框删除以及基因插入，得到如下突变株：利用50±10bp短同源臂对DSM 7029基因组的一系列100kb，200kb，500kb片段进行一步敲除，获得相应一系列突变株；通过对这些突变株生长曲线的测定，证实对DSM 7029基因组进行大片段的敲除能够明显的提高该突变株的生长速率和生物量。