[发明专利]高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用

说明书

高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用，包装质粒和膜囊质粒，所述包装质粒为pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev，囊膜质粒为VSV‑G，用于细胞转染的Buffer A:1M CaCl₂，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO₃，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基。利用4质粒表达系统共转染HEK 293T细胞，收集病毒上清，超速离心后获得滴度高达10¹⁰ TU/mL的病毒浓缩液，用其感染小鼠腹腔巨噬细胞两次，可达90%以上的感染效率。

技术领域

本发明涉及高滴度慢病毒的制备及其在高效感染小鼠腹腔巨噬细胞方面的应用。

背景技术

现有的转基因方法包括物理方法、化学方法和生物学方法。物理方法主要包括DNA显微注射法、电穿孔法和金属颗粒轰击法等；化学方法主要包括脂质体或受体介导的转染等；生物学方法主要指病毒感染。电转、脂质体介导的转染等方法安全性高，但效率较低，且难以实现外源基因的稳定永久表达。腺病毒载体系统感染效率高, 但目的基因不整合至靶细胞基因组, 表达时间短，而且能够激起宿主细胞的免疫反应，本身对细胞的毒性较大，使其应用逐渐减少。随着近年来慢病毒等新兴病毒载体的发展，以其可以感染分裂及非分裂细胞、容纳外源性基因片段更大等优点，逐渐受到科学界的青睐。

慢病毒(lentivirus)为RNA病毒，属逆转录病毒科，以HIV-1为基础构建的新型慢病毒载体(1entivirus vector, LV)系统是由慢病毒为骨架改造而来，且比逆转录病毒载体有更广的宿主范围。LV介导的基因转染有两大优点：一，可以将目的基因高效整合到宿主细胞的染色体上并随细胞增殖长期稳定表达；二，可以感染多种细胞类型，包括分裂细胞和非分裂细胞，且可以在体实现基因转导。在感染能力方面，可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。由此可见慢病毒已经成为现代细胞生物学研究中一种广泛应用的基因传递工具。从其安全性考虑，慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒，但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，因此操作时建议使用生物安全柜，穿实验服，戴口罩和手套，不要产生气雾或飞溅。

慢病毒滴度对基因导入效率至关重要，然而不同方法包装的慢病毒其滴度差异很大，能否制备高滴度的慢病毒是提高效感染效率的前提。影响慢病毒包装滴度的因素有很多，包括包装质粒、膜囊质粒的选择及其纯度，HEK 293T细胞状态、培养基条件，转染试剂等。虽然选用VSV-G膜蛋白包装的高滴度慢病毒提高了细胞的感染种类及感染效率，但是对不同细胞和组织的亲嗜性存在较大差别。目前，市场上出售的慢病毒滴度在10⁸-10⁹TU/mL，尚可满足部分实验需要，但对于小鼠巨噬细胞而言，其感染效率低，无法使目的基因在巨噬细胞上有效过表达。目前已有文献报道对于慢病毒感染人白血病单核细胞系THP-1效率达90%以上时，multiplicity of infection (MOI)须达到60，即意味着需消耗大量病毒，如何制备高滴度慢病毒已成其瓶颈，而如何高效感染啮齿动物原代巨噬细胞尚未见相关文献报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用，滴度可达到1012copies/mL，功能活性滴度达到10¹⁰ TU/mL，且可高效感染小鼠腹腔巨噬细胞，效率可达到90%以上。

技术方案：高滴度慢病毒的制备试剂盒，包括：包装质粒和膜囊质粒，所述质粒混合物为包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev，与囊膜质粒VSV-G，用于细胞转染的Buffer A :1MCaCl₂，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO₃，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基。