[发明专利]一种人凝血因子Ⅷ的制备方法

权利要求书

1.一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，制备方法依次包括：人血浆的融解；低温离心收集冷沉淀；冷沉淀溶解；K700滤板进行压滤；收集压滤液；调整pH值至6.46～6.66，加入2%氢氧化铝凝胶吸附；EK滤板进行压滤，收集压滤液；调节pH值和蛋白浓度，采用CUNODELP深层滤芯过滤，收集滤液；S/D法病毒灭活；调整pH值，离子强度；Q-Sepharose-FF离子交换柱进行上样，洗涤，洗脱，收集洗脱液；超滤，浓缩，稀配；0.22μm滤芯除菌过滤；无菌分装；冷冻干燥；干热病毒灭活；真空检测；成品入库；

其中收集的洗脱液用30KD超滤膜超滤浓缩，在超滤浓缩时采用两步梯度透析法，减少超滤导致的蛋白活性降低，降低制品中的聚山梨酯80残留量、磷酸三丁酯残留量和铝残留量；其中，两步梯度透析法为：

加入透析液①进行等体积超滤透析液3倍，再加入透析液②进行等体积超滤透析液3倍，用0.45um的滤芯过滤得人凝血因子Ⅷ原液；

透析液①配制方法：5.85g氯化钠，0.9g氯化钙，2.94g枸橼酸钠，12g甘氨酸，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5；透析液②配制方法：2.94g枸橼酸钠，12g甘氨酸，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5。

2.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，人血浆的融解；低温离心收集冷沉淀，称重；加入冷沉淀重量6倍溶解液，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在20～26℃。

3.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，冷沉淀溶解后，用K700滤板进行压滤，控制压力不大于0.2Mpa，出液温度为20～26℃，收集压滤液，再用0.5mol/L HCl调节pH至6.46～6.66；加入2%氢氧化铝凝胶，搅拌；开始用EK滤板进行压滤，控制压力不大于0.2Mpa，出液温度为20～26℃，收集压滤液，称重。

4.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，二步压滤法后收集压滤液，制得物用0.5M氢氧化钠溶液调节上清液pH至6.5～7.5；用蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于15.0g/L；用CUNO DELP深层滤芯过滤，收集过滤液，称重。

5.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，冷冻干燥采用复溶复冻工艺，得人凝血因子Ⅷ冻干品；复溶复冻工艺如下：

①制品常温进柜；

②隔板20分钟从常温降至-5℃，在-5℃保持60分钟；

③隔板120分钟从-2℃降到-30℃，在-30℃保持60分钟；

④隔板120分钟从-2℃降到-10℃，在-10℃保持60分钟；

⑤隔板120分钟从-2℃降到-30℃，在-30℃保持60分钟；

⑥开真空泵到真空达到0.3mbar稳定；

⑦60分钟隔板升温到-20℃，保持480分钟；

⑧90分钟隔板升温到0℃，保持240分钟；

⑨180分钟隔板升温到15℃，保持240分钟；

⑩240分钟隔板升温到30℃，保持120分钟；

⑪抽真空到0.05mbar，压塞，出柜。

6.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，所述人血浆的融解的溶解液配制方法：3000IU肝素钠，2.5g三羟甲基氨基甲烷，0.75g甘氨酸，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5，温度控制在20～26℃。

7.根据权利要求4所述的一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，所述蛋白浓度缓冲液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，0.9g氯化钙，4.2g氯化钠，1.2g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5。

8.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，

（1）、检疫期检疫合格的人血浆领取后，75%乙醇擦拭血浆袋表面，用注射用水冲洗，合并到融浆罐中，用30～35℃以下循环水融化，血浆温度控制不高于4℃；待融化后，离心，出液温度控制在0~4℃，收集冷沉淀，称重；

（2）、将步骤（1）的制得物冷沉淀加入其6倍重量的溶解液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在20～26℃；开始用颇尔公司的K700滤板进行压滤，控制压力不大于0.2Mpa，出液温度为20～26℃，收集压滤液，称重；溶解液配制方法：3000IU肝素钠，2.5g三羟甲基氨基甲烷，0.75g甘氨酸，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5，温度控制在20～26℃；

（3）、将步骤（2）的制得物上清液用0.5mol/L HCl调节pH至6.46～6.66；加入2%氢氧化铝凝胶，搅拌；开始用EK滤板进行压滤，控制压力不大于0.2Mpa，出液温度为20～26℃，收集压滤液，称重，测蛋白浓度；

（4）、将步骤（3）的制得物压滤液用0.5M氢氧化钠溶液调节pH至6.5～7.5；用蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于15.0g/L；用CUNO DELP深层滤芯过滤，收集过滤液，称重；蛋白浓度缓冲液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，0.9g氯化钙，4.2g氯化钠，1.2g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5；

（5）、按步骤（4）的制得物过滤液体积的1/10加入S/D溶液，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时；0.45μm滤芯过滤收集滤液；S/D溶液的配制方法：用清洁容器装850ml，70℃以上注射用水，在搅拌情况下加入聚山梨酯80 110g，再缓慢加入磷酸三丁酯33g，继续搅拌至澄清透明后降温至30℃以下，补加注射用水至1L；

（6）将步骤（5）所得过滤液用2M氯化钠溶液调整电导至20℃时35ms/cm，再调节pH至6.5～7.5，称重；

（7）、将步骤（6）的制得物用经平衡液平衡的Q-Sepharose-FF离子交换柱进行上样，上样完毕后用洗涤液洗涤柱子直至成基线，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，称重；平衡液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，1.0g氯化钙，17.5g氯化钠，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5；洗涤液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，1.0g氯化钙，19.5g氯化钠，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5；洗脱液的配制方法：2.5g三羟甲基氨基甲烷，1.0g氯化钙，58.5g氯化钠，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5；

（8）将步骤（7）收集的洗脱液用30KD超滤膜超滤浓缩至1/4后，加入透析液①进行等体积超滤透析液3倍，再加入透析液②进行等体积超滤透析液3倍，用0.45um的滤芯过滤得人凝血因子Ⅷ原液，送原液样品检测效价及pH值；透析液①配制方法：5.85g氯化钠，0.9g氯化钙，2.94g枸橼酸钠，12g甘氨酸，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5；透析液②配制方法：2.94g枸橼酸钠，12g甘氨酸，补加注射用水至1L，调节pH为6.5～7.5；

（9）依据人凝血因子Ⅷ原液检测结果，将步骤（8）得到原液加入透析液②进行稀配至24IU/ml，调整pH至6.5～7.5，即为稀配液；

（10）将步骤（9）得到的稀配液经0.22μm除菌滤芯过滤，过滤后进行分装，分装规格为10ml/瓶，即得人凝血因子Ⅷ半成品；

（11）将步骤（10）得到的人凝血因子Ⅷ半成品装入冷冻干燥机进行冷冻干燥，即得人凝血因子Ⅷ冻干品；

冻干工艺：

①制品常温进柜；

②隔板20分钟从常温降至-5℃，在-5℃保持60分钟；

③隔板120分钟从-2℃降到-30℃，在-30℃保持60分钟；

④隔板120分钟从-2℃降到-10℃，在-10℃保持60分钟；

⑤隔板120分钟从-2℃降到-30℃，在-30℃保持60分钟；

⑥开真空泵到真空达到0.3mbar稳定；

⑦60分钟隔板升温到-20℃，保持480分钟；

⑧90分钟隔板升温到0℃，保持240分钟；

⑨180分钟隔板升温到15℃，保持240分钟；

⑩240分钟隔板升温到30℃，保持120分钟；

⑪抽真空到0.05mbar，压塞，出柜；

（12）将步骤（11）得到的人凝血因子Ⅷ冻干品出柜，扎盖，后将制品装入水浴灭菌柜进行99～100℃、30分钟、压力0.4Mpa干热灭活；

（13）将步骤（12）得到的人凝血因子制品进行真空检测，真空合格制品送检，检验合格后包装；

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。