[发明专利]一种重组牛长效干扰素α及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种重组牛长效干扰素α及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

牛是我国重要的畜牧种类之一，随着集约化和规模化养殖的不断发展，牛病毒性传染性疾病的发病率逐年提高。许多牛的传染性疾病在国内大型规模化牧场长期流行，因疾病传染快，发病率、死亡率高严重制约着我国牛养殖业的健康发展；更为严重的是一些人畜共患传染病如牛的布鲁氏菌病、结核病等直接威胁人类的生命健康。

目前对牛传染性疾病的预防和治疗途径主要是通过疫苗接种和使用抗生素。大部分抗生素类药物以及传统的口服抗病毒药物，由于药物残留问题，给健康带来负面影响；而传统的疫苗，由于它的高特异性以及副作用，无法抵抗病毒变异和新型病毒不断出现给猪养殖业带来的巨大危害。干扰素以其广谱的抗病毒活性和广泛的免疫调节能力决定了其具有巨大的临床应用潜力，可以用来预防和治疗牛病毒性细菌性传染性疾病。

IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥作用的不同，分为α、β、γ三类。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。IFN-α主要生物学活性为具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性。

γ型IFN是由激活的T细胞和NK细胞产生，具有较强抗病毒和免疫调节功能。大量研究表明，干扰素γ除了具有广谱抗病毒功能外，对免疫系统也起着关键的调节作用，所以IFN-γ又称为免疫调节干扰素。虽然各种类型的干扰素均能够介导细胞对病毒感染的反应，但干扰素γ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用，因此干扰素γ具有极为重要的临床应用价值。

天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于在家畜临床上应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组牛长效干扰素α及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法，所述重组牛长效干扰素可显著提高牛干扰素的半衰期，较普通牛干扰素的半衰期提高11倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高牛自身的免疫应答。

本发明采取的技术方案为：

一种由牛干扰素γ与牛干扰素α组成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING400〈3〉所示，记为基因组2。

所述基因组1和所述基因组2均可编码所述融合蛋白。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0时被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现牛IFN-γ和IFN-α原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.24、0.25，GC百分比为39.8％、58.2％；而通过对牛IFN-γ和IFN-α基因优化后得到重组基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为1.0、0.97，GC百分比44.8％、54.6％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

本发明还提拱了含有基因组1或基因组2的表达载体。

进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。