[发明专利]一种双通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Cu2+

权利要求书

1.一种双通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Cu²⁺和Hg²⁺的方法，其特征在于：是以三[2,2’-二(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)-4-氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺，作为双通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Cu²⁺和Hg²⁺的荧光成像探针，通过探针对活性细胞孵育，再分别以Cu²⁺或Hg²⁺对孵育了探针的细胞再次孵育，用荧光倒置显微镜检测出清晰的绿色和红色荧光细胞图像，所述的探针的化学结构式为：

所述的通过探针对活性细胞孵育，再分别以Cu²⁺或Hg²⁺对孵育了探针的细胞再次孵育，用荧光倒置显微镜检测出清晰的绿色和红色荧光细胞图像；是具体按下述步骤进行：

(1)细胞培养：活性细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗的培养基中，在温度为37℃，5％CO₂及饱和湿度为100％的培养箱中培养，传代后，接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用培养基清洗细胞；

(2)探针对细胞孵育：将(1)的细胞中加入含10～40μM探针的培养液，培养液的组成为90％培养基、8％H₂O和2％乙腈，培养箱内孵育20～60min，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞后，置于荧光倒置显微镜下分别进行场明场和暗场拍照，明场下观察到清晰的细胞图像，暗场下没有观察到细胞图像；

(3)Cu²⁺对细胞染色：将(2)的细胞中加入含30～100μM的Cu²⁺的培养液，培养液的组成为90％培养基和10％水，在培养箱内孵育30～80min，进行细胞内探针对Cu²⁺染色，吸出含Cu²⁺的培养液，用新鲜培养基清洗细胞后，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Cu²⁺染色后的荧光像，细胞呈现明亮的绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像，探针在活性细胞中检测到微量Cu²⁺离子；

(4)Hg²⁺对细胞染色：将(2)的细胞中加入含50～150μM的Hg²⁺的培养液，培养液的组成为90％培养基和10％水，在培养箱内孵育30～60min，进行细胞内探针对Hg²⁺染色，吸出含Hg²⁺的培养液，用新鲜培养基清洗细胞后，分别置于荧光倒置显微镜的红色和绿色通道下观察探针对细胞内Hg²⁺染色后的荧光像；红色通道下细胞呈现红色荧光，拍摄得到清晰的红色荧光细胞轮廓影像；绿色通道下细胞呈现绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像；探针在活性细胞中检测到微量Hg²⁺离子。

2.如权利要求1 所述的双通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Cu²⁺和Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的荧光倒置显微镜；是绿色通道的激发波长为450nm～490nm，红色通道的激发波长为510nm～550nm的荧光倒置显微镜。

3.如权利要求1所述的双通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Cu²⁺和Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的活性细胞是；人体前列腺癌细胞，简称PC3细胞。

4.如权利要求1所述的双通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Cu²⁺和Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的培养基为改良型RPMI-1640培养基。

5.如权利要求1所述的双通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Cu²⁺和Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的探针；是以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和4-氯-7-硝基苯呋咱为主要原料合成；具体的合成路线为：

6.如权利要求1所述的双通道荧光成像检测活性癌细胞中微量Cu²⁺和Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的探针；所述的以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和4-氯-7-硝基苯呋咱为主要原料合成；是按下述方法进行合成：

1)中间体的合成：

N₂保护下，取25-30mmol的三(2-氨乙基)胺于100ml三口瓶中，量取20mL无水乙醇搅拌回流，再取2-5mmol的罗丹明B溶于40mL的无水乙醇中，用恒压漏斗缓慢滴加入三口烧瓶，滴完后回流30-40h，减压蒸去乙醇，分别用100mL二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，得中间体；

2)探针的合成：

在冰盐浴下100mL的三口瓶中，取0.5-1mmol中间体溶于40mL二氯甲烷中，再取1-2mmol4-氯-7-硝基苯呋咱，用20mL二氯甲烷溶解后以每秒1滴的速度缓慢滴入三口烧瓶中，滴完后加入3mL三乙胺，氮气保护下反应1.5-2.5h，撤去冰浴，减压蒸去溶剂得黑色固体，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/1的三氯甲烷/甲醇，得探针。