[发明专利]一种抑制基因表达的RNA干扰方法

说明书

本发明提供一种抑制基因表达的RNA干扰方法，将目的基因的siRNA和含shRNA的质粒同时显微注射入目的基因所在的宿主细胞中。本发明进一步提供一种改良的抑制绵羊早期孤雌胚胎NLRP7基因表达的RNA干扰方法，是将NLRP7基因siRNA干扰片段和shRNA干扰质粒混合注射入成熟卵母细胞中，所述siRNA如SEQ ID NO.6‑7、8‑9和/或10‑11所示，所述shRNA如SEQ ID NO.14、16和/或18所示；孤雌激活后发现NLRP7基因敲降后的胚胎出现了发育异常，说明NLRP7是绵羊早期孤雌胚胎正常发育所需的关键基因。本发明方法为研究基因的功能提供了新的方法。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种抑制基因表达的RNA干扰方法，具体地涉及一种特异性抑制NLRP7基因表达的RNA干扰方法。

背景技术

NLRs(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing)即NOD样受体家族，是生物体众多复杂的免疫识别系统之一，根据其结构域的不同又划分为好多亚家族，其中，将含有pyrin结构域的亚家族称为NLRP亚家族。NLRP基因家族首先在人身上被发现，共有十四个成员，分别命名为NLRP1-NLRP14。在灵长类动物上也有十四个成员，跟人的命名一样。相比与人的NLRP基因家族，小鼠的NLRP基因家族中没有NLRP7、NLRP8、NLRP11和NLRP13，但是NLRP1、NLRP4和NLRP9在进化的过程中发生了变化，又分别命名为NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c、NLRP4a、NLRP4b、 NLRP4c、NLRP4d、NLRP4e、NLRP4f、NLRP4g、NLRP9a、NLRP9b、NLRP9c，总共有二十个成员。在大鼠中也没有7、8、11、13，但只有NLRP4和NLRP9发生了变化，和小鼠不同的是，大鼠没有NLRP4g和NLRP9c。研究表明，NLRP基因在哺乳动物进化之前存在并发生复制，有一部分基因比较保守，如NLRP3(人和小鼠的同源性为80％以上)，然而，还有许多基因进化迅速导致动物谱系间序列的差异，如NLRP5(人和小鼠同源性为50％左右)和NLRP14(人和小鼠同源性为60％左右)。此外，除了部分成员发生复制外，还有许多成员消失了，例如，NLRP8和NLRP13似乎在小鼠的进化过程中退化了。在大动物上，该基因家族的研究并不是很多，许多物种的基因序列在NCBI 上都是预测的，尽管并不是在所有的物种中都有NLRP家族成员，但NLRP的同源基因在生物的进化中是高度保守的。近年来，好多研究表明NLRP家族成员不止在免疫系统中发挥重要作用，还在哺乳动物生殖系统中发挥作用。巧合的是，NLRP基因家族的进化过程中，主要基因的复制和消失都与生殖相关，比如NLRP4(复制)、NLRP7(缺失)、 NLRP8(缺失)、NLRP9(复制)、NLRP11(缺失)、NLRP13(缺失)和NLRP14等，这说明与生殖相关的基因在不同物种的系统发生过程中发生了快速的趋异进化。近年来的研究显示，对于人类和猴子等灵长类动物来说，许多NLRP基因在其配子和早期胚胎中表达，这表明NLRP基因在胚胎附植前的发育过程中起着某种作用(McDanielP等， 2009)。繁殖相关的NLRP基因聚集在人19号染色体上，而对小鼠来说，则是聚集到7 号染色体上。

NLRP7(NACHT，Leucine-rich repeat and PYD containing 7)是NLRP蛋白家族中的一员。NLRP7拥有NLRP蛋白家族通常的结构域，比如亮氨酸重复域、NACHT结构域和Pyrin结构域，其位于人类19号染色体q13.42位置，小鼠身上没有该基因。对于 NLRP7的研究主要集中在人和猕猴等灵长类动物身上，大动物上很少有报道，因此，我们选择绵羊为实验对象来研究NLRP7的功能。