[发明专利]利用巴豆酸激活Zscan4等二细胞期基因并延长端粒，提高化学诱导重编程效率的方法

说明书

本发明公开了一种利用巴豆酸激活Zscan4等二细胞期基因表达，延长端粒，以提高化学诱导重编程效率的方法。即在化学诱导过程中的第二阶段加入7mM的巴豆酸，可使最终的化学诱导重编程效率提高三倍左右。本方法获得的化学诱导多能干细胞(chemically induced pluripotent stem cells，CiPSCs)与正常的胚胎干细胞享有更接近的基因表达谱。机制上，在诱导中期加入巴豆酸，可以显著激活包括Zscan4等二细胞期基因表达，迅速延长端粒，从而降低端粒区域的DNA损伤，提高化学诱导重编程的效率。本方法诱导得到的化学诱导多能干细胞应用前景非常广泛，在组织工程、再生医学等方面具有巨大的应用潜能。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及提高化学诱导重编程效率的方法。具体而言，本发明涉及在化学诱导中期加入化学物质巴豆酸，通过激活包括Zscan4在内的一系列二细胞期基因的表达，迅速延长端粒，从而减少端粒区域的基因组损伤，提高最终的化学诱导重编程效率。

背景技术

近年来，小鼠和人诱导多能干细胞(下文称为iPS)已相继建立，这类细胞的建立需要依靠强制表达一系列外源转录因子组合，如Oct4，Sox2，Klf4等。但是介导外源基因表达的逆转录病毒或慢病毒有潜在的安全问题，不管是逆转录病毒,还是慢病毒,都会把外源基因整合到基因组DNA中,这就有可能引起插入突变，造成潜在的致癌风险，不利于iPS的临床应用。因此，降低基因整合风险和致癌性的方法之一就是减少外源转录因子，而这同时伴随着诱导效率的降低。加入一些化学小分子，如VPA,BIX,Vc等，可以显著提高重编程的效率，但是潜在的致癌风险依然使得iPS距离临床应用非常遥远。

通过不断的努力和尝试，邓宏魁课题组首次利用小分子化合物将小鼠成纤维细胞成功诱导为化学诱导多能干细胞(下文称为CiPS)，这就避免了外源基因整合进基因组的风险。但是过低的诱导效率和过长的诱导时间仍然大大地限制了CiPS的临床应用。

发明内容

本发明目的是解决因外源基因整合到基因组DNA中可能造成潜在的致癌风险以及减少外源转录因子而伴随着诱导效率降低的问题，提供一种利用巴豆酸激活Zscan4等二细胞期基因表达，延长端粒，以提高化学诱导重编程效率的方法。

本发明试图通过筛选其他化学小分子以提高化学诱导重编程的效率，并提高CiPS的质量。具体而言，利用一种小分子化合物巴豆酸，在化学诱导过程中第二阶段加入后，可以显著提高最终的化学诱导效率，并且这种方法得到的CiPS具备与正常胚胎干细胞更接近的基因表达谱，其安全性与有效性可转化于未来临床应用。

通过不断的尝试，我们发现7mM的巴豆酸(crotonic acid，以下简称CA)在化学诱导中期加入，可以使化学诱导效率提高3倍左右。

本发明技术方案

利用巴豆酸激活Zscan4等二细胞期基因表达并延长端粒，以提高化学诱导重编程效率的方法，包括如下步骤：

第1.MEF细胞的分离和原代培养；

通过贴壁培养，从处死的孕鼠组织获得原代MEF细胞；

第2.加入巴豆酸获得化学诱导多能干细胞；

将第1步中获得的原代MEF细胞，培养至多3代作为前体细胞用于化学诱导重编程，以提高化学诱导重编程效率。

其中，第2步所述加入巴豆酸获得化学诱导多能干细胞的方法如下：