[发明专利]一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法

说明书

本发明公开了一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法，其是将健康人的外周血单个核细胞转入anti‑CD3mAb，anti‑CD28McAb，Novonectin预先包被的培养瓶，加入含IL‑1α和IFN‑γ的无血清培养基，再加入多因子组合:VC、NAC、RAPA、IL‑7、IL‑15和IL‑21，之后补充无血清培养基及上述多因子组合；培养12～16天后，即可获得所述以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群。本发明方法细胞因子的联合应用可以对淋巴细胞的扩增产生协同作用，扩增倍数提高了，体外杀伤性和存活时间都明显提高，该方法具有安全性高、成本低廉等优点。

技术领域

本发明属于细胞生物工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法。

背景技术

记忆干T细胞是一种新发现细胞亚群，这类细胞具有干细胞的特性，即有多向分化潜能，在分化的时候又能维持自我更新，它既有初始T细胞((naive T)的标记，但是在做细胞功能研究时又表现出记忆T细胞的特征。

现有技术为了得到高含量的记忆T细胞常用流式细胞仪分选，这种方法对仪器、实验环境要求都很高，操作复杂，容易产生污染，分选过程对细胞有一定损伤和浪费。

关根晖彬等人的专利将外周血淋巴细胞加入到抗CD3抗体固相化烧瓶中，于含有IL-2的培养液中进行活化培养，以培养中的淋巴细胞群的细胞密度大于一定的阈值为指标、检测到淋巴细胞群中的记忆T细胞的占有率达到了期望的值，收获所述细胞群，进行冷冻保存；对所述冷冻保存细胞进行解冻、培养，加入IL2使其增殖，得到以记忆T细胞为主要成分的淋巴细胞群。该方法需要对细胞群进行冷冻保存，然后再进行解冻培养，在冻存细胞和解冻细胞过程中会造成一定的细胞损失，冻存剂会对细胞有一定的伤害，冻存和解冻的这一过程也耗费时间。在对细胞进行解冻培养时需要大量使用IL2这一种单因子进行增殖，很多实验已经证明大剂量单因子应用会产生毒副作用。IL2因子扩增体系培养的T细胞绝大部分分化为终末分化的效应细胞，存活时间短。传统的T细胞扩增培养体系却使得T细胞一部分重要生理功能丢失，如长期植入能力以及免疫系统重建能力。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法，该扩增方法可以提高以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的纯度和杀伤活性，使以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群更适用于临床。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种以记忆干T细胞为主要成分的淋巴细胞群的体外高效扩增方法，包括以下步骤：

(1)、用终浓度为1-10μg/ml的anti-CD3mAb，100-500ng/ml的anti-CD28McAb，2-10μg/ml的Novonectin预先包被培养瓶；

(2)、通过梯度离心法，采用淋巴细胞分离液分离健康人的外周血单个核细胞；

(3)、将单个核细胞吸出，使用PBS缓冲液洗涤细胞两至三次，使用台盼蓝进行染色，检测细胞活性并计数；

(4)、将单个核细胞转入步骤(1)包被的培养瓶中，加入含有200-1000IU/ml的IL-1α和200-1000IU/ml的IFN-γ的无血清培养基，使细胞密度达到2×10⁶个/ml，放入培养箱中培养；

(5)、第二天加入维生素C(VC)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、雷帕霉素Rapamycin(RAPA)、StemRegenin-1(SR1)、IL-7(IL-7)、IL-15(IL-15)和IL21(IL-21)，使其终浓度分别为10-100mg/L、1-10mM、50-200nM、0.5-1.0μM、10-100μg/L、10-100μg/L和500-1500μg/L，置于培养箱内继续培养；