[发明专利]猪带绦虫重组乳酸乳球菌胞内型表达系统的构建和鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪带绦虫重组活疫苗研究领域，具体为猪带绦虫TSOL18基因重组乳酸乳球菌胞内型表达系统的构建和鉴定方法。

背景技术

猪囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)俗称猪囊虫病(bladder disease)，是由猪带绦虫(Taenia solium,Ts)的中绦期幼虫猪囊尾蚴(cysticercus cellulosae)引起的一种严重危害畜牧业生产和人类健康的人兽共患寄生虫病，是国家卫生部规划防治的重点寄生虫病之一。本病呈世界性分布，主要流行于中非、南非、拉丁美洲、东亚和南亚等经济、卫生条件差的国家及地区。我国主要流行于黑龙江、吉林、云南、河南、河北、山东和广西等31个省市自治区。据近年普查，我国猪带绦虫的感染率为0.112％，局部地区高达0.66％～6.00％，感染人数126万，囊虫的感染率为0.14％～3.20％，感染人数300万。其中2.3％～25.0％的猪带绦虫病患者由于自身感染而伴有囊虫的寄生。因此研发安全高效的疫苗防治该病意义重大。

TSOL18基因相对保守，存在于激活的TSO中，具有良好的免疫原性和抗原性，被认为是最具发展前途的侯选疫苗基因。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)是LAB中最重要的模式菌，应用范围于食品、医药领域密切相关。随着基因工程技术的发展，选择具有高效、无毒副作用的L.lactis作为载体，已在细菌、病毒、肿瘤、寄生虫等领域构建了一系列基因工程疫苗。

就上述背景技术领域而言，尚未见猪带绦虫重组L.lactis的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供猪带绦虫重组乳酸乳球菌胞内型表达系统的构建和鉴定方法。

为达到上述目的，采用的技术方案为：

猪带绦虫重组乳酸乳球菌胞内型表达系统的构建和鉴定方法，包含以下步骤：

1)、TSOL18基因合成和引物设计：根据猪带绦虫TSOL18基因序列，采用基于PAS的方法，在引物的两端各设计了Sac I和Hind III酶切位点和保护性碱基，合成576bp的TSOL18基因；

2)、重组质粒pMG36e-TSOL18的构建及鉴定：合成的目的基因与表达载体pMG36e用Sac I/Hind III双酶切相连接，获得重组质粒pMG36e-TSOL18，转化至Top克隆菌株，抽提阳性质粒测序鉴定；

3)、猪带绦虫重组pMG36e-TSOL18/L.lactis的构建及鉴定：

3.1)、乳球菌的活化及感受态制备：取乳酸球菌MG1363菌液接种于GM17固体培养基平板，然后收集菌体，用1:100的甘油磷酸缓冲液重悬菌体；

3.2)、重组质粒pMG36e-TSOL18电转化MG1363：将获得的pMG36e-TSOL18质粒与感受态MG1363混合，进行冰浴和电击，加入蔗糖MRS培养基，然后进行涂布红霉素GM17平板培养，选取阳性菌落再进行红霉素液体培养基培养；

3.3)、阳性克隆鉴定：取上述3.2)步骤的培养菌液，离心弃上清，依次进行洗涤、重悬、沸水浴、冰浴、离心，取上清作为PCR模板待用；使用基因特异性的引物进行PCR鉴定，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

4)、蛋白表达鉴定：

4.1)、SDS-PAGE鉴定：选取未转化的乳酸球菌培养于GM17液体培养基中，挑取步骤3.3)鉴定为阳性的菌液，离心收集沉淀和上清；将沉淀在冰浴中进行超声破碎，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴4-8min，冷却后取上样，通过SDS-PAGE检测上清和胞内的蛋白表达情况；

4.2)、通过AKTA纯化TSOL18蛋白，使用Anti-TSOL18抗体检测纯化后的蛋白在15D左右有无目的条带；

4.3)、Western blot鉴定：取AKTA纯化TSOL18蛋白进行Western blot鉴定分析。

进一步，所述步骤3.1)中，菌液接种后保持不通风，30℃培养过夜，至OD值为0.2-0.8，然后将培养物冰浴10min，离心收集菌体，并用冷的甘油磷酸缓冲液洗涤菌体，再进行重悬菌体。

进一步，所述步骤3.2)中电击电转参数如下：电压2000V，电容25UF，电阻200Ω。