[发明专利]临床应用级脐带间充质干细胞及其分离制备方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及从脐带华通氏胶中分离获得高纯度、高活力间充质干细胞的方法。该方法通过筛选获得脐带组织，经消毒清洗、华通氏胶分离、组织块制备、组织块接种、细胞原代培养及传代培养等步骤，获得高纯度、高活力的脐带间充质干细胞。本发明使脐带间充质干细胞生产工艺更加标准和规范，特别适用于临床。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及到从脐带华通氏胶中分离临床应用级间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)存在于骨髓、脂肪、脐带等多种组织器官中，因其具有高度自我更新和多向分化潜能，在临床造血支持、促进干细胞植入和免疫调控等方面的应用日益受到人们的关注。在烧伤、骨折、缺损软组织填充、终末期肝病、心肌梗死、糖尿病足等创伤或疾病的治疗均证实了其安全性和有效性。

脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，其来源于发育早期的中胚层和外胚层。脐带取自于围产期健康产妇生产后的遗弃物，取材方便，对产妇和婴儿健康没有影响，伦理学争议小。脐带在间充质干细胞含量和增殖能力方面都优于骨髓，并且脐带来源的细胞免疫原性比骨髓低。脐带间充质干细胞具有无限增殖的可能，体外12代以内保持核型正常及端粒酶活性，说明脐带间充质干细胞无致瘤性。其表面抗原不明显，不表达MHC-Ⅱ类抗原，低表达MHC-Ⅰ类抗原，异体移植排异较轻，临床使用无需配型。脐带间充质干细胞能抑制T、B、NK、DC细胞的免疫调节作用，其异体免疫原性及免疫排斥很低。脐带间充质干细胞可以分化成多种组织细胞，可以作为种子细胞进行储存，用于衰老和病变等引起的组织器官损伤的修复。能分泌VEGF、bFGF、HGF等细胞因子，促进血管再生，分泌NGF、BDGF、G-CSF等神经营养因子，促进神经细胞的再生修复。

目前，已有多个单位申请了脐带间充质干细胞分离相关的专利，其中有使用胶原酶或复合酶消化进行细胞的分离(ZL201611173913.9、ZL201611174018.9、ZL201611037484.2、ZL201610910565.2、ZL201510395470.7等)，有将脐带进行去血管后剪碎或者直接剪碎后进行组织贴壁获取细胞(ZL201610910134.6、ZL201410751410.X、ZL201410515345.0、ZL201010605542.3、ZL201410515345.0、ZL201510191059.8等)，也有通过分离华通氏胶剪碎后贴壁获取细胞(ZL201710067279.9、ZL201610615998.5、ZL201610311244.0、ZL201510945799.6、ZL201510423138.7)。通过酶消化获取细胞的时间较短，但酶会对细胞的活力有一定的影响。直接剪碎贴壁操作简单，但细胞的纯度低，不利于获取纯度高的细胞。分离华通氏胶剪碎贴壁的方法，获取细胞纯度高，但细胞爬出的时间较长。因此，需要对脐带处理的方法进行改进，才能获取到活力更强、纯度更高的细胞。

发明内容

本发明的主要目的在于建立临床应用级脐带间充质干细胞的分离制备方法，所述脐带间充质干细胞来自于分离的华通氏胶。

本发明的技术方案如下：

本发明提供临床应用级脐带间充质干细胞的分离制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)获取人源特异性病毒血检报告结果为阴性的脐带；

(2)取组织保存液进行支原体检测后，处理脐带，分离华通氏胶，并用生理盐水充分洗涤华通氏胶；

(3)用无菌剪刀将华通氏胶剪碎，洗涤离心后，采用组织贴壁法培养脐带间充质干细胞，当细胞融合度达到80％以上时，加入消化酶进行消化处理后，过滤收集单细胞悬液，获得脐带间充质干细胞的原代细胞。

上述制备方法还包括以下步骤：