[发明专利]特异性识别甲基化修饰DNA碱基的TALE RVD及其应用

权利要求书

1.包含TALE重复结构域的蛋白在制备检测目标基因靶序列中的甲基化碱基5hmC的试剂中的应用，所述TALE重复结构域的一个或更多个RVD是FS。

2.检测细胞基因组中目标序列的特定位点上是否存在5hmC的方法，包括：

(1)将包含TALE的蛋白引入细胞，所述TALE靶向目标序列，所述TALE中识别所述特定位点的RVD是FS；

(2)然后将核酸酶引入细胞，所述核酸酶的靶向切割位点位于TALE靶序列中；

(3)检测目标序列是否被切割，由此判断目标序列的特定位点上是否存在5hmC；如果目标序列未被切割，则所述TALE结合所述目标序列，使得所述核酸酶无法结合该目标序列并切割，所述特定位点上存在5hmC；如果目标序列被切割，则所述TALE未结合所述目标序列，所述核酸酶结合该目标序列并切割，所述特定位点上不存在5hmC。

3.权利要求2的方法，其中所述核酸酶是核酸内切酶。

4.权利要求2的方法，其中所述核酸酶是Cas9核酸酶，且在步骤(1)中将所述Cas9核酸酶和sgRNA共同引入细胞。

5.包含TALE的分离的DNA结合多肽、包含功能结构域和TALE的融合蛋白、编码所述DNA结合多肽或所述融合蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、或包含所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞在制备靶向结合细胞中目标基因的靶序列的试剂中的应用，所述TALE包含的一种或更多种RVD是FS，目标基因的靶序列中在所述RVD的识别位点上是5hmC。

6.权利要求5的应用，其中所述功能结构域是调节基因表达的功能结构域、表观遗传修饰功能结构域，基因编辑功能结构域，或者荧光蛋白。

7.权利要求6的应用，其中所述调节基因表达的功能结构域是转录激活因子、转录抑制因子或其功能性片段，所述表观遗传修饰功能结构域是甲基化转移酶、去甲基化酶或其功能性片段，所述基因编辑功能结构域是核酸酶或其功能性片段。

8.权利要求7的应用，其中所述基因编辑功能结构域是核酸内切酶。

9.权利要求8的应用，其中所述核酸内切酶是FokI核酸内切酶或FokI核酸内切酶的DNA切割域。

10.包含功能结构域和TALE的融合蛋白或编码该融合蛋白的多核苷酸在制备调节细胞中目标基因表达的试剂中的应用，其中所述融合蛋白中包含的功能结构域是调节基因表达的功能结构域；

其中所述TALE包含的一种或更多种RVD是FS，目标基因的靶序列中在所述RVD的识别位点上是5hmC。

11.权利要求10的应用，其中所述调节基因表达的功能结构域是转录激活因子或其功能性片段，或者转录抑制因子或其功能性片段。

12.包含功能结构域和TALE的融合蛋白或编码该融合蛋白的多核苷酸在制备对细胞中目标基因进行基因编辑的试剂中的应用，其中所述融合蛋白中包含的功能结构域是基因编辑功能结构域；

其中所述TALE包含的一种或更多种RVD是FS，目标基因的靶序列中在所述RVD的识别位点上是5hmC。

13.权利要求12的应用，其中所述基因编辑是核酸切割，所述基因编辑功能结构域是核酸酶或其功能性片段。

14.权利要求13的应用，其中所述基因编辑功能结构域是核酸内切酶或其功能性片段。

15.权利要求13的应用，其中所述基因编辑功能结构域是FokI核酸内切酶或其DNA切割域。