[发明专利]三重转录因子及其在哺乳动物蛋白表达系统的应用

权利要求书

1.一种重组表达载体，其特征在于，为含有编码核酸的哺乳动物表达载体；所述编码核酸的碱基序列由编码ELL2转录因子的碱基序列、编码AFF4转录因子的碱基序列和编码CRTC2转录因子的碱基序列组成；

所述哺乳动物表达载体为含有CMV启动子的哺乳动物表达载体。

2.一种权利要求1所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，其包含下述步骤：

(1)将编码ELL转录因子、AFF转录因子和CRTC转录因子的基因分别与载体连接，得到含有三重转录因子的重组载体；

(2)将步骤(1)所得到的重组载体转化到受体细胞，筛选得到转录因子表达的载体；

(3)将步骤(2)所得到的转录因子表达的载体进行DNA测序，得到重组表达载体。

3.一种哺乳动物蛋白表达系统，其特征在于，

其通过将权利要求1所述的重组表达载体和LIF表达载体共同转染到细胞株中表达得到，

或通过将权利要求2制备得到的重组表达载体和LIF表达载体共同转染到细胞株中表达得到，

所述重组表达载体的总量与LIF表达载体的总量的比为1：1-5。

4.根据权利要求3所述的哺乳动物蛋白表达系统，其特征在于，所述细胞株选自于人胚胎肾细胞293或者中国仓鼠卵巢细胞中的一种。

5.一种权利要求3或4所述的哺乳动物蛋白表达系统的制备方法，其包含下述步骤：

(1)将重组表达载体和LIF表达载体总量比为1：1-5共同转染到细胞株中；

(2)1-3天后收集细胞，得到哺乳动物蛋白表达系统。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述LIF载体的制备方法包含下述步骤：将LIF及表达载体连接得到LIF表达载体。

7.一种哺乳动物蛋白的纯化方法，其包含下述步骤：

(1)收集权利要求3或4所述的哺乳动物蛋白表达系统细胞，加入裂解液，离心得到上清液；

(2)将步骤(1)所述的上清液与标签beads混合，离心去除上清液，然后加入高盐洗涤液洗涤；

(3)将步骤(2)所得的洗涤液离心，去除上清液，加入低盐洗涤液洗涤；

(4)用带有标记peptide进行洗脱，然后离心得到上清液，所述上清液即为哺乳动物蛋白。

8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述裂解液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、甘油、NaCl、EDTA、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制剂混合物，所述裂解液的加入量为每1×10 ⁷ 个细胞加入1-5ml的裂解液。

9.根据权利要求7或8所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述上清液与标签beads的体积比为20-50:1。

10.根据权利要求7-9任一项所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述高盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、甘油、NaCl、EDTA、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制剂混合物，所述高盐洗涤液的加入量为1-5ml。

11.根据权利要求7-10任一项所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述低盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、甘油、NaCl、EDTA、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制剂混合物，所述低盐洗涤液的加入量为1-5ml。

12.根据权利要求7-10任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述标签peptide与标签beads的体积比为3-5：1。

13.权利要求3或4所述的哺乳动物蛋白表达系统表达的蛋白，或权利要求5或6所述制备方法制得的表达系统表达的蛋白，或7~12任一项所述方法纯化得到的哺乳动物蛋白在制备促进干细胞生长、抑制干细胞分化的药物中的应用。