[发明专利]一种葛根SCoT分子标记的PCR反应体系

说明书

本发明公开了一种葛根SCoT分子标记的PCR反应体系，所述PCR反应体系总共有20µL，该PCR反应体系中含有DNA50ng，Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP0.25mmol/L，引物0.8μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U，余量为ddH₂O。目前报道的应用于葛根的分子标记方法只有ISSR、SRAP和RAPD三种，本发明是首次建立葛根SCoT‑PCR反应体系，弥补了葛根SCoT分子标记相关研究的空白，丰富了葛根分子生物学研究的手段和方法。利用本发明获得的SCoT‑PCR反应条带清晰、稳定性高、操作简单、成本低廉、多态性好，能够实现对葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种等相关领域的研究，具有很大的科学价值与应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种葛根SCoT分子标记的PCR反应体系。

背景技术

葛根（Pueraria lobata(wild.) Ohwi）是豆科葛属（Pueraria DC.）多年生植物，是中国卫生部首批批准的药食同源两用植物，素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美誉。葛根含有葛根素、黄酮、多糖等多种药用成分，具有解肌、透疹、止泻、除烦、降脂、降糖、解酒、美容丰胸等功效（李国辉等，2010；胥甜甜，2014）。葛根富含淀粉，可作为非粮生物质新能源，避开产业发展中＂与民争粮，与粮争地＂的瓶颈，具有巨大的开发潜力。此外葛根生长迅速、适应性好、抗逆性强，且根系深、水土保持能力强，加上其作为豆科特有的固氮能力，可作为贫瘠区域的绿化植物和土壤改良植物。2014国际葛根健康产业发展论坛透露，我国野葛和栽培葛面积近100万公顷，具有很好的市场前景。

葛根在中国种植历史悠久，但长期以来其遗传育种工作较为落后，基本靠采收野生资源供药用，对葛根的研究主要集中在药理研究、营养成分分析等方面，种质资源鉴定、遗传多样性分析、品种选育等没有得到足够重视。近年来，随着人们对药食同源两用食物的关注，葛根产业随之发展，葛根片、葛根粉、葛花茶、葛根保健饮料、葛根解酒饮料等葛产品的开发，葛根种质资源收集和鉴定、遗传多样性研究逐渐开展起来，但大多研究是采用田间性状等形态指标进行鉴定，容易受到环境、主观判断等因素的影响。采用分子标记的方法可以有效的避开以上弊端。目前关于分子标记在葛根上的研究尚少，仅有利用RAPD（周精华等，2013）、ISSR（郭艳艳等，2013；陈俊意等，2015；袁灿等，2017）、SRAP（陈大霞等，2011）这三种分子标记方法开展过研究，其他分子标记方法在葛根上的应用未见报道。

目标起始密码子多态性标记（SCoT）是Collard等（2009）在水稻上提出的基于SPAR（单引物扩增反应）的新的目的基因分子标记方法，其原理是根据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增。SCoT标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点，操作简单，成本低廉，多态性丰富，能有效地产生与性状联系的标记，是一种能跟踪性状的新的分子标记，有利于分子标记辅助育种。目前已有前人将该技术成功应用于龙眼（陈虎等，2010）、柑橘（韩国辉等，2011）、花生（熊发前等，2010）、菊花（李丕睿等，2013）、兰花（高岭等，2013）、牡丹（侯小改等，2011）和菠萝（陈香玲等，2012）等作物的遗传多样性分析中。虽然国内外陆续有人对葛根做了分子标记研究，但尚未见SCoT分子标记应用于葛根的相关研究报道。因此，建立葛根的科学合理的SCoT-PCR反应体系，寻求最佳理论组合，既可以加快试验进程，为后续工作提供科学的依据和指导作用，又可以提高分子标记辅助育种的效率，缩短育种年限，为进一步研究葛根遗传多样性及地理变化、相关标记开发、种源遗传分化等相关研究具有十分重要的意义。

发明内容