[发明专利]葡萄黑腐病菌实时荧光PCR检测方法及其专用引物探针组

说明书

技术领域

本发明涉及检疫性真菌的检测技术，具体涉及一种葡萄黑腐病菌实时荧光PCR检测方法及其专用引物探针组。

背景技术

葡萄黑腐病菌Phyllosticta ampelicida(Engelm.)隶属于叶点霉属(Phyllosticta)、球壳孢科(Phyllostictaceae)、葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、子囊菌门(Ascomycota)。

葡萄黑腐病菌已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，是一种检疫性植物病原真菌。目前，分布于美国、澳大利亚、新西兰、巴西、南非、希腊、印度、日本和我国局部地区。葡萄黑腐病菌可侵染葡萄的果实和枝叶，对鲜食葡萄和酒用葡萄的都有严重影响,使葡萄的产量和果实的质量、风味下降。

迄今为止，国内外检测葡萄黑腐病菌的方法局限于形态学检测方法，费时费力，且对检测人员专业素质要求较高，难以满足快速、准确、灵敏鉴定的检测要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄黑腐病菌实时荧光PCR检测方法及其专用引物探针组。

本发明首先提供了一种特异引物对，由引物PAF和引物PAR组成；

所述引物PAF为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物PAR为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

所述特异引物对的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)鉴定葡萄黑腐病菌；

(b2)制备用于鉴定葡萄黑腐病菌的试剂盒；

(b3)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌；

(b4)制备用于检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的试剂盒。

本发明还保护一种引物探针组，包括所述特异引物对和探针；所述探针的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团。所述探针，5'末端具有荧光报告基团FAM，3'末端具有荧光淬灭基团MGB。所述探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，进行PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

所述引物探针组的用途为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)鉴定葡萄黑腐病菌；

(b2)制备用于鉴定葡萄黑腐病菌的试剂盒；

(b3)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌；

(b4)制备用于检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的试剂盒。

本发明还保护所述特异引物对或所述引物探针组的应用，为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)鉴定葡萄黑腐病菌；

(b2)制备用于鉴定葡萄黑腐病菌的试剂盒；

(b3)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌；

(b4)制备用于检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌的试剂盒。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物对或所述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下(c1)或(c2)：

(c1)鉴定葡萄黑腐病菌；

(c2)检测待测样本是否含有葡萄黑腐病菌。