[发明专利]一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于仿生皮肤和生物材料领域，具体涉及一种三维多孔结构的人工皮肤及制备方法。

背景技术

疏松多孔结构的生物材料被广泛应用于人造器官、组织中，因为该结构利于细胞增殖、迁移，以及营养物质、氧气、代谢废物的输送，为细胞增殖和组织再生的微环境。研究结果显示，人造皮肤中的孔径可以显著影响皮肤细胞的粘附增殖、迁移。不同的种类的细胞在不同材料的组织工程支架中，生物学特性也大不相同。对于内皮细胞而言，其能适应的最大孔径为80微米左右，因内皮细胞在氮化硅支架中，无法跨越覆盖大于80微米的孔径；对于成纤维细胞而言，其在90微米左右孔径的氮化硅支架，以及38微米～150微米孔径的聚乳酸支架中，显示出更好的增殖、迁移性能。

除此之外，人天然皮肤组织学研究显示，靠近表皮和靠近皮下组织的真皮区域，胶原纤维和弹性纤维明显降低。该结果提示，真皮浅层和深层的组织间隙明显大于真皮中间层，即仿生皮肤中，孔径分布规律为浅层的孔径大于深层的孔径。

但是，目前仿生皮肤制备领域中，以下问题尚不明确：

问题之一：如何制备与天然皮肤有相似孔径梯度的仿生皮肤？

人造皮肤的结构显著影响接种细胞的活性和组织的性能。目前研究尚不明确，是否有一个“最佳”孔径来对应特定的细胞类型和支架成分。根据人类天然真皮研究结果显示，在不同深度，人真皮纤维空隙和纤维结构都不是均匀的。

但是，目前人工真皮支架倾向于设计成具有“最佳”孔径的均匀结构。然而，天然人真皮不仅结构并不是均匀的，而且孔径也变化非常大。文献报道，模仿软骨梯度结构的仿生多层胶原支架，与单层胶原支架相比，显著促进了小鼠成骨细胞增殖。由此可见，形态结构和孔径均对人工真皮支架产生重要影响。因此，与天然皮肤有相似孔径梯度的仿生皮肤，有望更加利于创面愈合(即浅层的孔径大于深层的孔径)。

问题之二：如何提高生物材料溶解度？

生物材料多为生物大分子结构，溶解度较低，难以配置成高浓度的溶液，而且天然生物材料杂质较多，需要经过纯化才能去除致热源、过敏原等对动物体有害的物质。通过常规方法难以制备结构密度高的生物材料支架。

因此，如何提高生物材料溶解度，且有效去除杂质，是制备高密度、复杂结构人造器官的必要条件之一。

问题之三：如何实现多层结构之间的无缝联结？

目前技术中，往往容易在材料制备阶段，实现材料融合。

但是，一旦单层材料做好之后，很难在不损坏单层结构的前提下，实现多层材料的无缝联结。

因此，实现材料无缝联结是构建复杂组合型人造器官的另一个必要条件。

针对以上问题，本发明方法拟从以下三方面解决：

第一，根据天然人类皮肤组织学证据，以及单层人工皮肤的生物实验结果，设计制备按照人天然皮肤的孔径梯度设计的多层仿生皮肤(即浅层的孔径大于深层的孔径)。通过动物实验验证其疗效。

第二，通过“溶剂-盐析-透析-溶剂”流程，进行生物材料溶液的纯化，且去除杂质，最终提高生物材料的溶解度。

第三，通过“溶剂水化-冷冻干燥”流程，实现材料无缝联结。利用可溶解特定材料的溶剂，首先进行“水化”处理，然后进行冷冻干燥，最终实现多层生物材料之间的无缝联结。

发明内容

针对上述情况，本发明目的是模仿天然真皮纤维分布稀疏规律，根据细胞实验、动物实验结果，提供一种孔径在30μm～200μm之间，且浅层孔径大于深层孔径的仿生皮肤及制备方法。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种与人类皮肤有相似孔径分布梯度的多层仿生皮肤及制备方法，包括以下步骤：

(1)通过“溶剂-盐析-透析-溶剂”序贯处理流程纯化生物材料，提高其溶解度：

将生物材料溶解于溶剂中，持续震荡，离心，取上清液，去掉沉渣。

往上清液中加入10％-15％NaCl溶液，盐析，取沉淀物。

将盐析沉淀得到的生物材料装入半透膜，透析掉盐离子。

透析后的生物材料再用上述溶剂溶解，备用。

(2)制作与人类皮肤有相似孔径分布梯度(浅层的孔径大于深层的孔径)的多层仿生皮肤：

将步骤(1)制得的溶液，等比稀释，配置成等比浓度梯度的生物材料溶液。

将上述溶液装入多孔板中，冰箱冷冻，然后放入冻干机中，冻干24-48h，用30％戊二醛蒸汽交联，6-12h，最后，用0.1M-0.5M甘氨酸溶液浸泡12-24h，中和残余的戊二醛。