[发明专利]从组织中分离胎盘间质细胞并培养成间充质干细胞的方法

说明书

本发明涉及从组织中分离胎盘间质细胞并培养成间充质干细胞的方法，还涉及该方法中所用的混合酶消化液。具体的，所述方法包括以下步骤：胎盘小叶的处理、混合酶消化及终止、收集原代细胞、原代细胞冻存、细胞复苏、和细胞传代等步骤。使用本发明方法可以有效的提高从胎盘分离间充质干细胞的效率。例如所得原代细胞是一群较纯的间质细胞(CD73表达大于60％，CD45不表达)，每克组织获取细胞数可达2.5×10⁷，且得率稳定，经传代培养所得间充质干细胞的P1‑P5代细胞均为间充质干细胞，阳性表达CD73、CD90、CD105大于98％，阴性表达CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA‑DR小于2％；P5代细胞G2期细胞小于1％，增殖能力强，未进入分裂期；在特异性诱导培养基刺激下，有向成骨细胞，成脂细胞，成软骨细胞分化的能力。

技术领域

本发明涉及从胎盘中分离干细胞的方法，特别涉及从胎盘中分离间充质干细胞的方法，更特别的是涉及一种使用本发明所述独特配方的消化酶组合物从而从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法。使用本发明方法可以有效的提高从胎盘分离间充质干细胞的效率。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每10⁵～10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。

现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。