[发明专利]定量检测重组慢病毒的滴度的方法

说明书

本发明涉及一种定量检测重组慢病毒的滴度的方法，先用待测样品感染靶细胞，并提取感染后靶细胞中的基因组DNA，然后测定基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及hTERT基因的拷贝数。根据WPRE元件的拷贝数和hTERT基因的拷贝数计算平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数。之后根据靶细胞的总数和平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数计算单位体积的待测样品中含重组慢病毒的颗粒数，即得到待测样品中重组慢病毒的滴度。上述定量检测重组慢病毒的滴度的方法操作简便，能够在不借助荧光标记物的条件下准确定量测定重组慢病毒的滴度。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种定量检测重组慢病毒的滴度的方法。

背景技术

重组慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，是目前应用最广泛的基因运载工具之一，广泛应用于转基因动物的制备和基因治疗研究中。

重组慢病毒制备的过程中，通常用病毒的滴度来衡量重组慢病毒的制备是否成功以及重组慢病毒的质量，因此滴度测定是一个重要的步骤。现有技术中，测定重组慢病毒滴度的主要方法有流式细胞术(FACS)、酶联免疫(ELISA)法、金标试纸法和定量PCR法。

其中，FACS法是最为准确的测定重组慢病毒滴度的方法。该法先用病毒液感染靶细胞(通常为293T细胞)，之后通过流式细胞术测定其中被成功感染的细胞的比例。该方法虽然可准确测定重组慢病毒的实际感染能力，所测滴度数据能准确反映病毒的实际感染能力，但该方法需要重组慢病毒载体表达荧光标记基因(如绿色荧光蛋白GFP)，对缺乏此类标记基因的重组慢病毒则无能为力。

ELISA法和金标试纸法是定量检测的都是重组慢病毒颗粒中P24蛋白的表达水平，从而推算病毒滴度。在实际情况中，由于病毒液里总是含有一定的游离P24蛋白，因此通过ELISA法测定的重组慢病毒滴度通常都会偏高；金标试纸法虽然操作简便，所需时间短，但它只能起到定性的目的，无法对慢病毒滴度进行准确定量测定。

传统的定量PCR法可测定病毒感染的靶细胞中平均每个细胞基因组中病毒基因组的拷贝数，可在一定程度上反应重组慢病毒的滴度。但是该方法虽然在无标记基因重组慢病毒的滴度测定中可行，但获得慢病毒基因组的拷贝数后其仍需依赖有荧光标记物的重组慢病毒作为对照才能准确计算待测样品中重组慢病毒的滴度，操作相对繁琐和不便。

综上，传统的检测方法均无法实现在不借助荧光标记物的条件下准确测定重组慢病毒的滴度。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够在不借助荧光标记物的条件下准确测定重组慢病毒的滴度的定量检测重组慢病毒的滴度的方法。

一种定量检测重组慢病毒的滴度的方法，包括以下步骤：

用待测样品感染靶细胞，并提取感染后所述靶细胞中的基因组DNA，其中所述待测样品中含有重组慢病毒；

测定所述基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及hTERT基因的拷贝数；

根据所述WPRE元件的拷贝数和所述hTERT基因的拷贝数计算平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数，其中，平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数＝(所述WPRE元件的拷贝数/所述hTERT基因的拷贝数)×2；及

根据所述靶细胞的总数和所述平均每个靶细胞中重组慢病毒的颗粒数计算单位体积的所述待测样品中含重组慢病毒的颗粒数，得到所述待测样品中重组慢病毒的滴度。

在一个实施方式中，所述测定所述基因组DNA中WPRE元件的拷贝数以及hTERT基因的拷贝数的步骤包括：

将所述基因组DNA与WPRE元件上游引物以及WPRE元件下游引物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，获取扩增所述WPRE元件的Ct值；