[发明专利]一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于疫苗生产技术领域，具体涉及一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法。

背景技术

1951年Earle等成功开发出能促进动物细胞体外培养的培养基。1957年Graff用灌注培养法悬浮培养细胞，数量达到1×10¹⁰-2×10¹⁰cell/L。1962年Capstick成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞，标志着动物细胞大规模培养技术的起步。1967年，Van Wezel开发了微载体，并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养与微载体培养标志着大规模培养技术的开始，细胞生产病毒疫苗也成为细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。从20世纪八十年代起，国内、外研究机构开发出了低血清、无血清细胞及悬浮培养技术，并应用到口蹄疫疫苗生产中，规模从2000L-8000L生物反应器。2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，做为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。国际上悬浮培养技术发展较快，已趋向成熟，是疫苗、抗体等生物制品生产的普遍生产工艺模式。

当今生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式生物反应器中，用无血清培养基和低血清培养工艺悬浮培养细胞进行生产。

伪狂犬病又称Aujeszky病是由伪狂犬病毒(Pseudrabies virus,PRV)所引起的多种家畜及野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要特征的急性传染病，尤其是危害全球养猪业的重大传染病之一。随着中国规模化和集约化养猪业的发展，从国外引进的种猪相应增多，伪狂犬病随之传入并不断蔓延扩大，给养猪业造成了巨大的经济损失，中国将其列为二类传染病。由于被感染的动物种类极多，病毒可在自然界反复循环存在，属于典型的自然疫源性疾病，因此也是极难防制的传染病之一。由于PRV目前尚无有效的药物治疗方法，主要依靠疫苗接种、隔离感染猪群、淘汰隐性感染动物得到控制。

目前，国内生产伪狂犬疫苗主要依靠转瓶培养方法，与转瓶培养工艺相比，悬浮培养最大的技术优势在于：第一，单位体积内有效工作细胞数量增加；第二、全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动力强度的同时减少人为操作因素影响；第三、生物反应器容积的扩大，提升了终端产品的均一性，结合后期纯化工艺，不但产品产量明显提高，产品的质量获得提高；第四、生产疫苗所用劳动力和车间、水、点、原材料、能源等成本远低于传统培养工艺，综合成本大大降低。与贴壁细胞微载体培养相比，更节约成本、易于规模化放大生产，提高产品的安全性和稳定性，但是目前暂无生产伪狂犬弱毒活疫苗的悬浮培养工艺及其应用的相关报道。

如何通过无血清培养和生物反应器悬浮培养工艺进一步提高兽用伪狂犬疫苗的质量和产量，是目前本领域研究的重点和难点。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，可实现伪狂犬病毒的大规模扩增，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤：

(1)种子细胞活化

将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为8％的低血清悬浮培养基(BBSMMD910)活化，培养3代后，然后用血清含量为5％的低血清悬浮培养基培养3代，再用血清含量为2％的低血清悬浮培养基培养3代；

(2)种子细胞的无血清驯化

将低血清悬浮培养基中血清含量从2％降低至1％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.5％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.2％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0，采用无血清悬浮培养基BSFM连续传代培养，每代培养72h，至培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，停止驯化；

(3)在生物反应器中培养

将驯化后的种子细胞置于生物反应器中培养，培养3-6天，观察细胞密度及活力的变化；

(4)伪狂犬病毒的增殖

将伪狂犬冻干种毒接种于生长良好的ST单层细胞中进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24-48h，待病变达到80％以上时，收获伪狂犬病毒液；因悬浮细胞对病毒的敏感性比贴壁细胞要低，因此将伪狂犬病毒在贴壁繁殖一代，再接悬浮细胞才能获得高滴度的病毒含量；

(5)接种病毒