[发明专利]半滑舌鳎IGF‑I蛋白及其体外表达制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎IGF-I蛋白及其体外表达制备方法与应用。

背景技术

生长激素-胰岛素样生长因子轴(GH/IGF-I axis)在鱼类生长发育过程中起着关键的生理调控作用。IGF-I是生长轴的下游调控因子，在进化上较为保守，其在硬骨鱼类生长、生殖、代谢、渗透压调节、行为、摄食和免疫等方面都具有重要的生理功能。为了促进IGF-I在鱼类养殖生产中应用，科研和养殖从业者希望能将IGF-I成熟肽在体外表达生产，获得IGF-I的蛋白产品后作为功能性生长代谢或免疫调节剂，以饲料添加剂等方式用于专用配合饲料研制。已有研究表明，重组IGF-I蛋白作为促生长或代谢调控因子，通过注射、浸泡或饲料添加的方式可有效促进养殖鱼类的生长代谢，且鱼类对外源重组蛋白尤其是同源的重组蛋白吸收快、代谢快,不会在体内产生累计，因而安全可靠。所以,利用基因工程表达手段获得重组鱼类类胰岛素生长因子并用于养殖鱼类生长调控，在水产养殖业中具有重要应用价值。目前，已利用基因工程手段在原核表达系统(大肠杆菌)中成功实现了鲈鱼、罗非鱼、草鱼、虹鳟、大菱鲆等鱼类的IGF-I体外重组表达，获得了有生物活性的IGF-I重组蛋白，为鱼类IGF-I在养殖生产中的应用奠定了基础。但是，原核表达系统存在许多难以克服的缺点：如原核宿主菌本身可能会产生内毒素，过量表达可能会导致非生理反应；原核表达系统产生的目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。为克服原核表达载体的不足，研究者们开发了真核表达系统，其优点是包括靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，避免了基因的非特异性激活或抑制；与原核表达相比，诱导基因表达效率显著提高；严格调控基因表达，获得的蛋白产物具有生物活性，无需分离、变性、复性等复杂处理过程。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。半滑舌鳎是我国重要的海水养殖经济鱼种，已成为我国鲆鲽鱼类养殖产业三大主导种类之一。半滑舌鳎具有明显的生长差异性别二态性，即雄鱼生长速度较雌鱼慢2-3倍，不利于产业的持续发展。如能利用具备生长代谢调控功能的基因产物来研制相应的生物制品，实现对养殖半滑舌鳎生长差异和代谢的人工调控，将会为养殖产业发展带来巨大经济效益，应用前景广阔。目前，已证明IGF-I在半滑舌鳎生长发育和代谢过程中具有重要的生理调控作用，但由于尚无成熟的IGF-I蛋白产品，因而尚未在养殖生产中应用。另外，目前市场上也未见半滑舌鳎养殖专用的功能性的生长代谢调控专用添加剂。

发明内容

为了解决上述技术难题，促进IGF-I在半滑舌鳎养殖生产中的应用，本发明提供一种半滑舌鳎IGF-I蛋白的体外真核表达制备及应用方法，利用按照酵母密码子偏好性改造过的半滑舌鳎IGF-I成熟肽序列，添加酶切位点和6×His标签序列后与真核表达载体构建了重组表达载体，并在酵母工程菌中成功实现了IGF-I的高效表达，获得了具有生物活性的半滑舌鳎IGF-I重组蛋白，以饲料添加剂的形式应用后具有明显的促生长效果。

本发明通过以下技术方案实现：

一种半滑舌鳎IGF-I蛋白，所述的蛋白的核苷酸序列为SEQ IDNO:1；

一种半滑舌鳎IGF-I蛋白，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:3；

本发明提供一种半滑舌鳎IGF-I蛋白的体外表达制备方法，它包括成熟肽序列改造、重组表达载体构建、重组表达载体诱导表达和重组蛋白纯化；

所述的成熟肽序列改造，为了进行高效表达，对半滑舌鳎IGF-I成熟肽的核苷酸序列SEQ IDNO:1根据酵母菌的密码子偏好性进行改造，获得适宜在酵母菌内高效表达的核苷酸序列SEQ IDNO:2；

所述的重组表达载体构建，在目的核苷酸序列SEQ IDNO:2上添加酶切位点和His×6标签后与真核表达载体pPICZaA进行重组，构成可表达氨基酸序列为SEQ IDNO:3的半滑舌鳎类胰岛素生长因子I(IGF-I)多肽的重组表达载体pPICZaA-IGF-I。

进一步，添加酶切位点是指在目的核苷酸序列上游添加XhoI酶切位点，在下游添加XbaI酶切位点，并在目的核苷酸序列上游引入毕赤酵母蛋白酶Ste13酶切位点；

进一步，添加His×6标签是指添加于目的核苷酸序列下游，便于表达后目的蛋白的镍柱纯化。