[发明专利]能敲低内源性PD-1表达的CIK及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种能敲低内源性PD‑1表达的CIK及其制备方法与应用。本发明提供了制备能敲低内源性PD‑1表达的CIK细胞制剂的方法，包括：A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；B)向步骤A)所得CIK中转入能敲低内源性PD‑1表达的载体，培养13‑16天后收获细胞，从而制得所述能敲低内源性PD‑1表达的CIK细胞制剂；所述能敲低内源性PD‑1表达的载体上含有多个串联的靶向PD‑1的miRNA的编码基因；所述多个为2‑30个。实验结果表明，该载体可以大大降低CIK细胞中内源PD‑1的表达水平，从而显著的提高了CIK细胞的肿瘤杀伤活性。

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，涉及一种能敲低内源性PD-1表达的CIK及其制备方法与应用。

背景技术

CIK(Cytokine-Induced Killer Cells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有肿瘤杀伤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，临床上已经有大量的病例证实其肿瘤杀伤活性。

PD-1(程序性死亡受体)是一种表达于T细胞表面的蛋白质分子，当PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合时可抑制下游NF-κB基因的转录，抑制干扰素-γ的分泌，从而抑制T细胞的杀伤活性。PD-L1或PD-L2表达于多种肿瘤细胞，如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌以及尿路上皮癌等肿瘤组织。T细胞表面的PD-1与表达于肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2结合所引起的T细胞细胞毒活性抑制是肿瘤细胞逃避免疫监视和杀伤的重要机制之一。采用PD-1抗体或PD-L1抗体阻断PD-1与PD-L1、PD-L2的结合，可使T细胞的肿瘤杀伤活性不受抑制，从而提高T细胞杀肿瘤的效果。研究证实，采用PD-1单抗静脉输注治疗恶性黑色素瘤、肺鳞癌、霍奇金氏淋巴瘤、结肠癌及肾癌等肿瘤收到良好的治疗效果。然而，静脉输注PD-1抗体所需抗体量大，成本很高；同时血液成分、淋巴组织微环境等成分会影响PD-1抗体与T细胞表面PD-1的结合。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核细胞中存在的一种RNA降解机制。当病原感染真核细胞或者采用人为的方法将双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入到真核细胞后，这些双链RNA被RNase III家族的成员Dicer加工成21-23bp的双链干扰RNA(shortinterfering RNA,siRNA)。每个siRNA随后被整合到RNA诱导的干扰复合体中(RISC)，该蛋白复合体可以将siRNA靶向到与其互补的转录本的响应序列，导致转录本的切割、降解或者转录抑制。小RNA(microRNA,miRNA)是一种可以诱导基因沉默的内源性RNA，它大概22bp长，可以通过RNAi通路来诱导基因沉默。不同于短发夹RNA(shRNA)，miRNA经常以簇的形式被一个转录本编码，该转录本可能有几kb长并含有发夹结构，其表达由RNA聚合酶II启动。柄环结构的pri-miRNA由核RNase III Drosha降解成70bp左右的前体miRNA(pre-miRNA)，该前体miRNA由exportin-5从核内转运到胞浆。随后前体miRNA被Dicer处理成22bp左右的成熟miRNA，然后被整合入含有miRNA的RAN诱导的沉默复合体。成熟的miRNA通过对mRNA切割或者翻译抑制来调控基因的表达。靶基因的切割可以通过人为改变靶基因或者miRNA的序列来完全互补。

发明内容

本发明的目的是提供一种能敲低内源性PD-1表达的CIK及其制备方法与应用。

本发明所提供的制备能敲低内源性PD-1表达的CIK细胞制剂的方法，具体可包括如下步骤：

(A)利用细胞因子体外诱导PBMC分化为CIK；