[发明专利]一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种高立体选择性的新型苯丙氨酸脱氨酶突变体及其应用，该突变体是原核生物Anabaena variabilis的苯丙氨酸脱氨酶的氨基酸序列通过定点突变而产生的，即第311位的谷氨酰胺突变为谷氨酸，第448位的谷氨酸突变为苏氨酸，该突变体可特异选择性催化合成D‑芳香丙氨酸，所述突变体的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明获得的突变体同时具有活力高、热稳定性高等优良性能，为其在手性D‑芳香丙氨酸合成中的大规模、低成本的工业应用奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体及其应用。

背景技术

手性D-芳香丙氨酸广泛应用于医药、农药和食品工业领域，如D-苯丙氨酸被用作生产治疗2型糖尿病药物“那格列奈”、β-内酰胺抗生素及新型抗肿瘤药物的前体。生产D-芳香丙氨酸的方法有发酵、化学合成、酶催化等方法。由于D-芳香丙氨酸代谢过程复杂，采用工程菌发酵的产量太低，达不到工业化生产的要求，因此目前工业生产D-芳香丙氨酸最主要的方法是化学合成，但是由于合成的立体选择性低，合成的产物是对消旋体，为获得高纯度的D-芳香丙氨酸，需要昂贵的手性拆分试剂，而且合成的原料都具有剧毒，生产过程复杂，导致D-芳香丙氨酸的价格昂贵。酶催化法是一种最具前景的生产方法，因为酶具有反应条件温和，立体选择性高，反应副产物少，环境友好等优点。具有催化合成D-芳香丙氨酸的酶有转氨酶、D-氨基酸氧化酶、酰胺酶、海因酶等，然而目前接近工业化生产的是采用海因酶和氨甲酰水解酶两种酶连续催化。该方法中，以DL-5替代海英作为原料，在海因酶的作用下，DL-5替代海英生成N-氨基甲酰-D-苯丙氨酸，然后在氨甲酰水解酶的作用下，水解生成D-苯丙氨酸(D-phe)。这种方法是两种酶参与的合成过程，其中由于氨甲酰水解酶的活性、稳定性较海因酶低，在生产过程中氨甲酰水解酶是限制性因素，导致产率低。而且该方法的原料价格昂贵，DL-5替代海英是通过L-5-替代海英经过消旋酶消旋获得，而海因消旋酶不稳定，活性低，消旋产率低，导致原料价格昂贵。为降低D-芳香丙氨酸的生产成本，需改进现有的生产方法。

由于苯丙氨酸脱氨酶在碱性条件下具有立体选择性，能一步催化3-芳香基丙烯酸加氨合成D-芳香丙氨酸，而且原料3-芳香基丙烯酸是一种工业原料，容易生产，价格低廉，以其作为苯丙氨酸脱氨酶的底物生产手性D-芳香丙氨酸，能大幅度降低生产成本。但苯丙氨酸脱氨酶的立体选择性不高，产物是L，D-型芳香丙氨酸的混合物，工业生产中，副产物L-型的产物难以分离，导致产物D-芳香基丙氨酸光学纯度不高，为此需要改善苯丙氨酸脱氨酶的活性，降低L-芳香丙氨酸的生成能力。

近年来，基因工程技术广泛应用于改造酶的立体选择性，并取得非常好的效果，但是该技术在成功改善苯丙氨酸脱氨酶立体选择性的应用未见文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体，使其应用于合成D-芳香丙氨酸的方法，提高底物转化率和产物D-芳香丙氨酸的光学纯度，满足工业化生产的要求。

本发明的技术方案为：一种高立体选择性的新型苯丙氨酸脱氨酶突变体，该突变体是原核生物Anabaena variabilis的苯丙氨酸脱氨酶的氨基酸序列通过定点突变而产生的，即第311位的谷氨酰胺突变为谷氨酸，第448位的谷氨酸突变为苏氨酸，该突变体可特异选择性催化合成D-芳香丙氨酸，所述突变体的蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种编码该突变体的DNA分子，所述DNA分子核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

进一步地，所述DNA分子以来源于原核生物Anabaena variabilis的苯丙氨酸脱氨酶的基因作为模板，通过PCR定向突变得到。

进一步地，PCR定向突变采用的如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQID No.7所示的双引物对。