[发明专利]用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应

权利要求书

1.一种多重PCR方法，包括

在第一次扩增反应中使用靶标特异性嵌套引物对扩增多种靶核酸，所述嵌套引物对包括针对每个靶核酸的正向-内侧引物，正向-外侧引物，反向-内侧引物，反向-外侧引物，其中嵌套引物的浓度是200-1000nM，并且其中所述正向-内侧引物和反向-内侧引物包括附加的核苷酸以提供对所述多种靶核酸不特异的附加序列，使得用此引物对靶核酸的扩增也会在所生成的扩增子中加入共用引物的结合位点，该共用引物与靶标特异性引物不同，其可以用来进一步扩增不相关的靶核酸扩增子，从而产生含有共用引物结合位点的核酸扩增子；

拯救所述核酸扩增子；以及

在第二次扩增反应中使用与所述共用引物结合位点结合的共用引物扩增所述核酸扩增子，

其中拯救是指将扩增子与第一次扩增的至少一部分引物分离，

其中所述靶标特异性嵌套引物选自由下列各项组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和它们的组合。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸选自由病毒、细菌和真菌核酸组成的组。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸获自人临床样品。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸获自来自动物的临床样品。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述共用引物选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和其组合组成的组。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述拯救所述核酸扩增子的步骤还包括从在第一反应体系中完成的扩增中取小样品以提供用于在第二反应体系中第二次扩增的扩增子。

7.一种用于进行权利要求1-6中任一项所述方法的引物试剂盒，其中所述引物试剂盒包括SEQ ID Nos:1-2,SEQ ID NOs:3-6,8-11,13-16,18-21,23-26,28-31,33-36,38-41,43-46,48-51,53-56,58-61,63-66,68-71,73-76,78-81,83-86和88-91所示的引物和SEQID NOs:7,12,17,22,27,32,37,42,47,52,57,62,67,72,77,82,87和92所示的探针。