[发明专利]基于温度响应性液体弹珠的三维细胞培养器及构筑和使用方法

说明书

本发明涉及一种基于温度响应性液体弹珠的三维细胞培养器及构筑和使用方法，结合了液体弹珠的三维细胞培养器，将温度敏感性的共聚物修饰的不同种类颗粒作为温度响应颗粒，在其上滴加不同的细胞培养液，形成具有对不同温度响应行为的液体弹珠，从而可以作为三维细胞培养器。将在生物医学细胞培养领域具有广阔的应用前景。本发明的优点在于：三维细胞培养器制备方法快速，易批量生产；液体弹珠的球形培养器赋予细胞黏附、增殖的良好三维模板，采用控制温度的方法，可以实现复杂细胞层结构的培养及无损伤性脱附的过程，且液体弹珠具有优异的稳定性和气体通过性，能够有效地保证细胞的存活。

技术领域

本发明属于胶体与界面科学领域，涉及一种基于温度响应性液体弹珠的三维细胞培养器及构筑和使用方法，该弹珠的球形培养器赋予细胞黏附、增殖的良好三维模板，采用控制温度的方法，可以实现复杂细胞层结构的培养及无损伤性脱附的过程，且液体弹珠具有优异的稳定性和气体通过性，能够有效地保证细胞的存活。

背景技术

传统的细胞回收方法主要有酶解法和机械法，但两种方法均在某种程度上损伤膜蛋白造成细胞功能缺失，为此发展非酶解非机械方式将细胞与培养机制分离的的技术是目前的研究热点。近年来，采用温敏型聚合物PNIPAM可有效的替代传统的方法进行细胞回收，该方法称之为细胞片层技术Cell Sheet Engineering(CST)。具有显著的优点使其受到研究者的广泛青睐，首先其相变温度接近于人体温度，且此方法仅通过控制细胞培养温度，就能实现细胞包含膜蛋白和粘附蛋白的共同脱离，且保护了细胞间连接蛋白不受破坏。

PNIPAm是一类典型的可用于修饰细胞培养基的温度敏感性聚合物。其主要工作原理原理主要利用其温敏行为，在温度高于PNIPAm的最低临界温度时进行细胞培养，PNIPAm显示出疏水性，细胞在其表面附着、扩张和增殖。当温度降低至32℃以下，PNIPAm表面变为亲水性，在表面和培养细胞间形成水化层，只利用温度变化特性使得粘附在培养皿表面的细胞层状分离。避免了蛋白酶的消化作用产生细胞破损。截止目前已经发展了大量的关于PNIPAm及其共聚物在二维表面修饰细胞培养基获得细胞片层的技术，但CST细胞片层技术还停留在传统二维细胞培养层面上，该方法缺乏由细胞基质构成的立体支架，无法形成细胞生长、分化所需的整体微环境，且缺乏体内微环境中特异性生长因子及分化因子，因而附在底物平面上生长的细胞只能呈二维伸展，对于如何实现细胞层技术的3维细胞培养是一项巨大的挑战。

液体弹珠是由颗粒包裹微量液体构成的复杂液滴体系，它将传统的微量液滴移动的液-固界面转变为新的固-固界面，大大降低了接触角滞后效应，可简便的实现微量液滴的操控。近年来已在微反应器，细胞培养，微量液体传输等领域显示出较大的应用潜力。之所以适用于细胞培养，得益于其壳层的类似多孔膜的结构，能使O₂和CO₂能在膜界面处进行自由交换，保证细胞生长的条件；疏水的颗粒界面提供的非粘性表面使得细胞都悬浮在培养液中，受限的液体体积促进了其界面与细胞的充分接触，从而有益于细胞的聚集和生长，打破了细胞贴壁生长的二维增殖。

发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种基于温度响应性液体弹珠的三维细胞培养器及构筑和使用方法。

技术方案

一种基于温度响应性液体弹珠的三维细胞培养器，其特征在于包括温敏聚合物修饰的无机微纳米颗粒和细胞培养液；将温敏聚合物修饰的无机微纳米颗粒包覆细胞培养液，得到三维细胞培养器。

所述无机微纳米颗粒为纳米二氧化硅、纳米四氧化三铁、或氧化石墨烯。

所述温敏聚合物为聚N-异丙基丙烯酰胺PNIPAM均聚物，或聚N-异丙基丙烯酰胺与聚丙烯酸的共聚物PNIPAM/PAA。

一种构筑所述三维细胞培养器的方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：以化学接枝法制备温敏聚合物修饰的无机微纳米颗粒；