[发明专利]一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物样本保存技术领域，具体涉及一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法。

背景技术

大熊猫是我国的濒危野生动物，在大熊猫的保护遗传学研究中，学者需要通过评估大熊猫的遗传多样性来提出相应的保护建议，而样品采集是学者获得遗传学数据的基础。由于大熊猫粪便样品的资源丰富、易获得，且不干扰大熊猫的活动、对其造成伤害，加上DNA提取技术的进步，粪便DNA已成为学者获得野外动物遗传学数据较为广泛和可行的取样方法。

尽管粪便样品有以上的优点，但是粪便DNA存在浓度和质量低下、易降解、含有PCR抑制剂等问题，往往造成PCR扩增成功失败（Tende T, Hansson B, Ottosson U et al: Evaluating preservation medium for the storage of DNA in African lion Panthera leo faecal samples. Current Zoology 2014, 60(3):351-358.；Reddy PA, Bhavanishankar M, Bhagavatula J et al: Improved Methods of Carnivore Faecal Sample Preservation, DNA Extraction and Quantification for Accurate Genotyping of Wild Tigers. Plos One 2012, 7(10).），进而导致遗传学结论的不可靠性，同时降低了藉此提出的管理或者保护建议的可信度。研究证实，有效的粪便保存方法可以提高PCR扩增成功率（Tende T, Hansson B, Ottosson U et al: Evaluating preservation medium for the storage of DNA in African lion Panthera leo faecal samples. Current Zoology 2014, 60(3):351-358.）。关于大熊猫粪便样品的保存方法报道的仅有甲醛和乙醇、-20℃冷冻法（方盛国, 冯文和, 张安居等. 佛坪三官庙地区大熊猫种群数量的DNA 指纹分析. 应用与环境生物学报 1996, 2(3):289- 293.；张保卫,魏辅问,李明等.大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法.动物学报 50（3）：452-458）。由于甲醛毒性较大且保存效果不佳，近年来已不被使用；乙醇虽然无毒且保存效果好，但乙醇容易泄露，在航空运输中禁止携带，不便于运输；-20℃冷冻法由于需要反复冻融DNA，长期保存效果不佳。尽管其他物种的最佳粪便DNA保存方法已有报道，但粪便DNA保存方法的效果随着物种、生存环境的不同而不同。因此，我们仍然需要发明一种适用于大熊猫的长期保存效果佳、方便运输的粪便保存方法，这对于大熊猫的保护遗传学研究来说具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种长期高效保存大熊猫粪便中DNA的方法。

本发明一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，包括以下步骤：

a、样品采集：采集排便时间＜12h的大熊猫粪便；

b、样品预处理：将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中22～26h；

c、样品保存：取出b步骤浸泡后的粪便样品，干燥，转入底部铺满硅胶珠的离心管中，排尽瓶中空气。

进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中b步骤中采用无菌镊子将a步骤采集的大熊猫粪便的表层去除，浸没在无水乙醇中24h。

上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中c步骤中所述干燥温度为60～70℃，干燥时间为1.5～2.5h。

进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中c步骤中所述干燥温度为65℃，干燥时间为2h。

上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中c步骤中采用脱脂棉排尽瓶中空气。

进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中所述样品保存之后还包括DNA提取及检测步骤。

进一步的，上述一种长久高效保存大熊猫粪便中DNA的方法，其中所述DNA提取及检测步骤具体包括以下步骤：