[发明专利]一种浓缩发酵液中水蛭素的方法

说明书

本发明涉及一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，属于生物医药技术领域。所述方法包括在水蛭素发酵液中加入反相色谱填料进行吸附，洗脱吸附沉淀，收集流出液，即为水蛭素浓缩液；所述反相色谱填料由硅胶基质表面健合疏水基团形成。整个吸附洗脱过程操作简单，浓缩的同时还具有纯化作用，水蛭素蛋白回收率可达70％以上。

技术领域

本发明涉及一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

1884年，人们在医用水蛭(hirudo meduimalis)中发现有很强的抗凝物质，命名为水蛭素(hirudin Hir)。到1950年以后，从医用水蛭唾液腺中分离得到具有生物活性的水蛭素。七十年代初确定，水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂。八十年代，确定了水蛭素的氨基酸序列，并对其构数关系及其生物学作用机理进行了一系列研究，水蛭素是一个由多种异构体所组成的家族，常见有三种分别为HV-1、HV-2和HV-3，异构体间有高度的同源性，都是由65个氨基酸所组成的单链多肽，分子量约为7000Da，氨基酸组成分析表明，水蛭素分子中不含精氨酸和色氨酸，而富含谷氨酸、天门冬氨酸以及谷氨酰胺和天门冬酰胺，比活性约为10000IU/mg蛋白。

由于水蛭素具有重要的医药价值，而天然水蛭素来源限制，故国内外医药界均着重研究通过基因工程获得重组水蛭素。基于已知的水蛭素氨基酸序列，在体外合成相应序列DNA片段，插入重组表达载体，在大肠杆菌和酵母细胞中表达。毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统是具有分泌优势的高表达真核系统。其分泌表达量高，酵母工程菌稳定性好，高密度发酵条件下，能大大提高产物的表达水平等。

重组水蛭素的成功构建表达后，需要对酵母发酵中的水蛭素进行浓缩，浓缩的同时也要去除发酵液中培养基的成份、菌体残留部分，利于下步纯化。传统浓缩水蛭素多采用陶瓷膜、纤维素膜等超滤膜浓缩的方法，此种浓缩技术具有以下难点:1、超滤浓缩后水蛭素活性蛋白回收率在40％左右，蛋白回收率较低；2、因发酵过程中会产生蛋白降解酶，而该降解酶会水解水蛭素活性，因此超滤浓缩时间过长，不利于水蛭素活性的稳定，且超滤膜的消耗较大，浓缩成本高。

“反相色谱”早在20世纪40年代初就有人提出。但它真正被广泛应用，却是在微粒型多孔硅胶键合相出现之后。特别是硅胶基质键合C₁₈、C₈烷基以及苯基填料的出现，使该技术得到发展，被极其广泛的用于各个领域。这类填料的特点是颗粒刚性好，并有良好的选择性，pH值适应性在2-8之间。本发明将反相色谱填料应用于发酵液中水蛭素的浓缩，解决传统浓缩手段带来的问题。

发明内容

本发明的目的是针对目前浓缩技术出现的问题，提供一种使用反相色谱游离吸附浓缩发酵液中水蛭素的方法，快速浓缩的同时提高水蛭素蛋白回收率。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种浓缩发酵液中水蛭素的方法，所述方法包括在水蛭素发酵液中加入反相色谱填料进行吸附，洗脱吸附沉淀，收集流出液，即为水蛭素浓缩液；所述反相色谱填料由硅胶基质表面健合疏水基团形成。

反相色谱填料其表面键合疏水基团，具有弱疏水特性，而水蛭素蛋白表面存在一些疏水区域，蛋白质分子中的疏水区域可以与填料表面产生疏水性相互作用，这种疏水作用可以通过利用盐浓度来调节，使水蛭素蛋白吸附在反相色谱填料表面，然后通过增加洗脱液中有机溶剂(如乙腈、乙醇)的浓度来实现水蛭素蛋白洗脱。这种吸附洗脱过程即完成了发酵液中水蛭素的浓缩。

作为优选，所述疏水基团为C₈烷基。反相色谱填料疏水表面烷基链长度对蛋白质的反相保留和蛋白质的活性回收有很大影响，烷基链越长，固定相疏水性越强，为使蛋白质洗脱，流动相有机溶剂的含量较高，因此疏水性过强，会导致蛋白质分子不可逆吸附和生物活性损失，因此选用C₈烷基作为键合相，实现了水蛭素蛋白完全吸附和活性的最大保留。