[发明专利]一种表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌及其构建方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌及其表达方法和用途，具体地说是一种表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌及其构建方法和用途。

背景技术

右旋糖苷(Dextran)，又名葡聚糖，是蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，主要由葡萄糖基α(1-6)苷键连接而成。因其具有安全、无毒、生物相容性好等多种优点，已被广泛应用于医药、食品、色谱分析等多个领域。右旋糖酐及其衍生物被广泛应用于医药、食品、化工等众多行业，市场需求巨大(全球每年的需求近几百亿美金)。由明串珠菌发酵的右旋糖酐70是目前公认的优良血浆替代品，由面包酵母发酵的右旋糖酐可作为食品添加剂改善食品的口感。1941年，Hehre E.J.首次报道出以蔗糖为底物无细胞合成右旋糖酐，在那之后不久，合成这一反应的酶被命名为右旋糖酐蔗糖酶。

右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucase,EC2.4.5.1)是一种分泌型葡萄糖基转移酶，属于糖苷水解酶70家族(GH70)，是葡聚糖蔗糖酶领域中研究较早较热门的一类酶。可以将蔗糖分子中的D-葡萄糖基转移到受体分子上，催化程度的差异性可以合成右旋糖酐和低聚糖，同时伴有果糖的生成。通过右旋糖苷蔗糖酶的催化来生产右旋糖酐。右旋糖酐蔗糖酶的产生菌多为肠膜状明串珠菌和链球菌，根据碳水活性酶数据库Carbohydrate-ActiveEnzymes Database(CAZy；http://www.cazy.org)分类统计，到2017年为止GH70家族已发现了343种菌，其中94株右旋糖酐蔗糖酶表达菌株为肠膜状明串珠菌，193株为链球菌属，33株为乳杆菌，22株为魏斯氏菌，一株为酒球菌。目前右旋糖酐蔗糖酶合成的葡聚糖及其衍生物在食品、健康医疗、材料等领域都有了广泛的应用。

现有的右旋糖酐蔗糖酶热稳定性较差。其较低的温度适应性及在逆境下活性降低的性质低限制了它在食品、医药行业、工业生产中的应用。通常高稳定性被认为是一个经济优势可以降低酶的消耗和补偿速率。此外，更稳定的酶可能对反应速率、工艺温度有积极的影响。获取活性高、热稳定性高的右旋糖酐蔗糖酶，对于提高产品品质、获得很好的工业应用潜力、实现该酶的诸多应用具有重要的意义。因此，利用分子生物学技术获得新型的耐热、高稳定性且酶活高的的右旋糖酐蔗糖酶酶源是目前研究热点之一。目前，对于不同来源菌的葡聚糖蔗糖酶在国内外均有研究，在定点突变改造及引入二硫键提高其某些性质获得新型的葡聚糖蔗糖酶均有部分文献报道，关于该酶的分子改造及耐热机制的研究也越来越受到关注。

蛋白质工程已经成为一个重要的工具来改善右旋糖酐蔗糖酶的热稳定性使其更适用于工业生产。本发明的目标就是通过对本实验室现有的原始右旋糖酐蔗糖酶进行定点突变的蛋白质分子改造，筛选得到一种产酶活力较高、耐热性及稳定性较好的重组右旋糖酐蔗糖酶菌株，为其在食品工业及医药工业的潜在应用做准备。

通过使用基因工程改造手段提高右旋糖酐蔗糖酶的热稳定性将成为以后国内外研究热点和解决问题的关键。

发明内容

本发明旨在提供一种表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌及其构建方法和用途，为右旋糖酐的工业生产提供更节约的生产条件。本发明所要解决的技术问题是通过基因工程的手段构建能耐热、酶活高的表达右旋糖苷蔗糖酶(Dextransμcrase)的基因工程菌株，并通过诱导制备该酶用于较高温右旋糖酐的生产。

本发明表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌，具有耐高温表达右旋糖苷蔗糖酶且酶活较高的特性。

本发明基因工程菌由含pET28a(+)/dex-YG基因的重组表达质粒经定点突变得到双突变体P473S/P856S后在宿主菌中转化而得，并经过卡那霉素抗性筛选和测序验证。所述宿主菌为E.ColiBL21(DE3)，购自全式金生物技术有限公司。所述重组表达质粒是用dex-YG基因插入到载体pET28a(+)中构建而成，载体pET28a(+)购自Novagen公司。所述dex-YG基因是以肠膜状明串珠菌基因组为模板，运用PCR扩增技术克隆得到的。发明人已成功完成了dex-YG基因的克隆、重组表达质粒的构建、双位点的定点突变和测序工作。

本发明表达耐热型右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌，是将由克隆得到的dex-YG基因插入到表达载体pET28a(+)中得到的重组表达质粒pET28a(+)/dex-YG作为模板，并经过473位和856位双位点的定点突变，筛选后得到耐热、酶活高的双突变体P473S/P856S，于宿主菌E.ColiBL21(DE3)中转化得到的重组工程菌dex-YG-thMU01。